ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 72-79
УДК 576.80
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ И СПЕКТРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФИКОЦИАНИНА И ЕГО СУБЪЕДИНИЦ ИЗ Anabaena variabilis CCC421
© 2014 г. H. Чакдар*, **, С. Саха***, С. Пабби*
*Центр сохранения и использования сине-зеленые водорослей, отдел микробиологии, Институт сельскохозяйственных исследований, Нью-Дели-12, Индия **Национальное агентство сельскохозяйственных микроорганизмов, Кушмаир, Маунат Бханжан,
PIN-275101, Индия
***Отдел сельскохозяйственных химикатов, Институт сельскохозяйственных исследований,
Нью-Дели-12, Индия e-mail:sunil.pabbi@gmail.com Поступила в редакцию 25.10.2012 г.
Из диазотрофных цианобактерий Anabaena variabilis CCC421 осаждением сульфатом аммония и последующими диализом и очисткой на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой был выделен пигмент фикоци-анин с выходом 36% и степенью очистки 2.75. Выделенный фикоцианин состоял из 2 субъединиц массой 17 и 18 кДа, которые были идентифицированы как а и Р-субъединицы методами элктрофо-реза в ПААГ с Na-ДДС и MALDI-TOF. Разработан метод разделения и обнаружения субъединиц фикоцианина из A. variabilis CCC421 с использованием ВЭЖХ на колонке C5 в сочетании с флуоресцентной или фотодиодной детекцией. Флуоресцентный метод обнаружения был более чувствительным по сравнению с фотодиодным. Исследованы адсорбционные и инфракрасные спектры выделенного фикоцианина, получены спектральные характеристика его а и Р-субъединиц. Результаты показали, что субъединицы содержали 1 или 2 фикоцианобилиновых группы в качестве хромофоров.
DOI: 10.7868/S0555109913060056
Цианобактерии или сине-зеленые водоросли, представляют собой класс грамотрицательных, фо-тосинтезирующих бактерий, которые осуществляют кислородный фотосинтез аналогично высшим растениям. Вместо хлоропластов цианобактерии обладают набором специфических внутриклеточных мембран, известных как тилакоиды, где осуществляется и фотосинтез и дыхание. В этих структурах располагаются большие водорастворимые супрамолекулярные комплексы белков, известные как фикобилисомы. Фикобилисомы представляют собой агрегаты светособирающих белков, т.е. фикобилипротеинов (ФБП), прикрепленных к стромальной стороне тилакоид-ных мембран цианобактерий. Такие комплекы дополняют фотосинтетические пигменты и могут составлять вплоть до 40—60% от общего растворимого белка в клетках [1]. Яркие цвета ФБП обусловлены в основном присутствием кова-лентно связанных простетических групп, содержащих открытую цепь тетрапиррольных хромофоров, называемых фикобилинами. Они бывают синего цвета, это фикоцианобилин (ФЦБ, ^макс ~ ~ 600—670 нм), красного цвета, это фикоэритроби-лин (^макс ~ 540—575 нм), желтого цвета, это фико-уробилин (^макс ~ 490—500 нм) и фиолетового цвета,
это фикобиливиолин (^макс ~ 575 нм), также известный как криптовиолин. Эти хромофоры, как правило, связаны с полипептидной цепью в консервативных позициях с цистеином тиоэфирной связью. [2]. Эти яркие, водорастворимые белки могут быть разделены на 3 класса на основе их спектральных характеристик: фикоэритрины (^макс ~ ~ 565 нм), фикоцианины (^макс ~ 620 нм), а аллофи-коцианины (^макс ~ 650 нм). Также было показано, что у сине-зеленых водорослей в небольших количествах присутствует четвертый ФБП, известный как аллофикоцианин Б (^макс ~ 670 нм) [3].
Введение билипротеинов в качестве флуоресцентной метки в клетки или макромолекулы [4] находит широкое применение в высокочувствительных методах флуоресцентного анализа, при флуоресцентно-активированном клеточном сортинге, проточной цитометрии, флуоресцентном иммуно-анализе и флуоресцентной микроскопии. Было показано что аллофикоцианин (АФЦ) и фикоцианин являются особенно перспективными для использования либо с перенастраевыми цветными лазерами или лазерами с более высокими длинами волн, как например, гелий-неоновые лазеры [5, 6].
Фикоцианины имеют 2 субъединицы, а именно а и в, которые связаны в (ав)-протомер, кото-
рый может также существовать как триммер (ав)3 или гексамер (ав)6 [7]. В C-фикоцианин-протеи-не каждый из 3 ФЦБ-хромофоров содержит мономер (ав). Было показано, что три ФЦБ кова-лентно связаны с консервативными остатками цистеина Cys а-84, в-84 и в-155. Таким образом, тример C-фикоцианина содержит 3 а-ФЦБ и 6 в- ФЦБ, а гексамер содержит 6 а- ФЦБ и 12 в-ФЦБ. Фикоцианин был выделен из таких цианобакте-рий, как Spirulina platensis [8—10], Synechococcus [11, 12], Nostoc [13—15], Anabaena [16], Calothrix [17], Oscillatoria [18] и Phormidium [19]. В основном эти работы были сосредоточены на выделении пигмента из различных цианобактерий, однако для детального исследования билибелков необходимо исследование их субъединичного состава, типа и состава билинов, анализ аминокислотной последовательности, разделение субъединиц. В литературе описано несколько методов разделения билибелков: гель-фильтрации, полупрепаративный электрофорез, ионообменная хроматография, но большинство из них достаточно длительны и не универсальны, то есть неприменимы ко всем ФБП в целом [20]. О разделении субъединиц ФБП методом жидкостной хроматографии уже сообщалось ранее в работе [21]. Авторы использовали градиентный метод элюции с крупнопористой колонки С4 системой растворителей, состоящих из 0.1%-ной трифторуксусной кислоты (ТФУ) и 0.1%-ной ТФУ в смеси ацетонитрил-изопропанол (2 : 1 об./об.). Разделение субъединиц ФБП из Anabaena sp. проводили с использованием фотодиодного детектора. Зола и Бьянкетти [22] продолжили работы Свансона и Глейзера [21], разработав метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием различных сочетаний носителей и подвижной фазы. В последующей работе Зола с соавт. [23] пришли к выводу, что для разделения АФЦ и субъединиц фикоцианина метод ВЭЖХ является более эффективным, чем электрофорез в ПААГ с Na-ДДС. Метод также можно использовать для количественного определения каждой субъединицы. Все методы жидкостной хроматографии использовались с применением диодного детектора для слежения за разделением.
Цель работы — разработка простого метода ВЭЖХ на колонке с широкими порами C5 с использованием флуоресцентного и диодного детекторов для разделения а- и в-субъединиц очищенного фикоцианина из А. variabilis CCC421 и дальнейшего спектрального исследования состава субъединицы и содержания билинов.
МЕТОДИКА
Рост и поддержание культуры. Культуры А. variabilis CCC421 были приобретены в Центре по сохранению и использованию сине-зеленых водорослей (CCUBGA, IARI, Нью-Дели-12, Индия). Культура поддерживалась в безазотистой среде BG-11 [24] при температуре 28 ± 2°С и освещенности 52—55 мкмоль фотонов м-2 с-1 и соотношении циклов свет-темнота 16 : 8 ч.
Экстракция и определение фикоцианина. Культуру А. variabilis CCC421 (500 мл) в логарифмической фазе роста (14 дней) центрифугировали при 2000 g. Полученный осадок ресуспендировали в 100 мл буфера для экстракции (20 мМ ацетатный буфер, рН 5.1, содержащий 50 мМ NaCl и 2.0 мМ NaN3). ФБП экстрагировали методом многократного замораживания, то есть повторением циклов замораживания (—20°С) и оттаивания (до комнатной температуры), которое проводили до тех пор, пока клеточная масса не приобретала зеленоватый оттенок. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 3000 g 10 мин, полученный экстракт в дальнейшем обозначали как неочищенный. Количество фикоцианина определяли с использованием стандартного метода, описанного в работе [25], степень его чистоты определяли по следующей формуле: степень чистоты = OD620/OD280.
Предварительная очистка фикоцианина. Фико-цианин осаждали (NH4)2SO4, добавляя его в неочищенный экстракт до 65%-ного насыщения, и выдерживали в течение ночи при 4°С. Осадок отделяли центрифугированием при 27000 g в течение 15 мин при 4°С, растворяли в 10 мл буфера для экстракции. В дальнейшем растворенный осадок (10 мл) подвергали диализу в буфере для экстракции с использованием диализных мем-бран-70 (ММО-12—14 кДа, "HiMedia", Индия). Диализ проводили дважды, заменяя 1000 мл буфера для экстракции. Первую замену проводили, когда диализ проходил при комнатной температуре, и вторую, когда диализ проводили в течение ночи при 4°С. Полученный диализат фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0.45 мкм ("Sar-torious", Германия).
Очистка с помощью анионообменной хроматографии на ДЭAЭ-целлюлозе. ДЭАЭ-целлюлоза 11 была получена в "Sisco" (Индия). Для очистки использовали колонку размером 18 х 2 см. Колонку уравновешивали 150 мл 20 мМ ацетатного буфера, рН 5.1. Десять мл пробы, полученной после диализа и фильтрации, с помощью шприца наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. После этого колонку промывали 50 мл 20 мМ ацетатного буфера, рН 5.1, для удаления несвязавшегося бел-
Таблица 1. Стадии очистки фикоцианина из A. variabilis CCC421
Стадии Объем, мл Фикоцианин, мкг/мл Выход,% Степень чистоты = OD620/OD280
Неочищенный экстракт 100 38 100 0.29
Осаждение сульфатом аммония 10 370 97.36 1.17
Диализ 10 320 84.20 1.18
Хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе 5 275 36.20 2.75
ка. Белок элюировали линейным градиентом рН в интервале от 3.76 до 5.1 в том же буфере, скорость элюции составляла 20 мл/ч. Фракции собирали по 5 мл.
Определение спектра поглощения. Спектр поглощения определяли сканированием образца в диапазоне длин волн 300—750 нм с использованием спектрофотометра Specord 200 ("Analytikjena", Германия).
Определение спектра поглощения в ИК-обла-сти. Инфракрасный спектр (ИК) выделенного лиофилизированного образца был получен с использованием спектрофотометра Bruker Alpha FT-IR spectrophotometer (Германия).
Обращеннофазная ВЭЖХ. Разделение субъединиц фикоцианина с помощью ВЭЖХ проводили с использованием колонки Discovery BIO Wide pore C5 ("Supelco", "Sigma-Aldrich", Германия) с широкими порами (250 х 4.6 мм), заполненной пористыми частицами кремнезема размером 5 мкм (диаметр пор 300 Ä). Оптимальная эффективность разделения достигалась при скорости потока 1.0 мл/мин. Все растворы были профильтрованы через 0.5 мкм мембранный фильтр и дегазированы методом пропусканием через раствор гелия. Оптимизацию условий хроматографического разделения проводили с и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.