БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 3, с. 500-507
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 53.086
И ССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОФИЗИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ МЕХАНИЗМА БАКТЕРИАЛЬНОГО СИНТЕЗА НАНОЧАСТИЦ СУЛЬФИДА СЕРЕБРА МЕТАЛЛВОССТАНАВЛИВАЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ Shewanella oneidensis MR-1
© 2014 г. А.С. Шебанова*, Т.А. Воейкова**, А.В. Егоров*, Л.М. Новикова**, И.Н. Крестьянова**, Л.К. Емельянова**, В.Г. Дебабов**, М.П. Кирпичников* ***, К.В. Шайтан* ****
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1;
**ФГУП Государственный научно-исследовательский Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1;
***Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, Г СП-7, ул. Миклух о-Маклая, 16/110;
****Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: n_shebanova@mail.ru Поступила в p едакцию 03.04.14 г.
Показано, что биоcинтез наночастиц cульфида cеpебpа в миллимоляpном pаcтвоpе солей тиоcульфата натpия и азотнокислого cеpебpа эффективно пpоиcxодит при использовании как живых, так и pазpушенныx ультpазвуком клеток Shewanella oneidensis MR-1, а также мембpанной фpакции этих клеток. Наночастицы, cинтезиpованные в пpиcутcтвии живых клеток, имеют средний pазмер 7,8 ± 1,5 нм, в присутствии pазрушенных ультразвуком клеток - 6,5 ± 2,0 нм. Форма наночастиц в обоих случаях близка к сферической. Также обнаружено, что синтез наночастиц происходит в бесклеточной фракции раствора тиосульфата натрия, ранее инкубированного с клетками S. oneidensis MR-1 и затем соединенного с раствором азотнокислого серебра. В данном случае частицы имеют в основном удлиненную форму, их размеры составляют (11 ± 4) х (24 ± 6) нм. В контрольном эксперименте при использовании растворов солей сульфида натрия и азотнокислого серебра без инкубации с клетками наночастицы обнаружены не были. Установлено, что биосинтез наночастиц осуществляется при проведении реакции биосинтеза как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Наночастицы не образуются при использовании клеток, инактивированных повышенной температурой, как было показано нами ранее. Полученные данные указывают на важную роль нативных структур клетки в образовании наночастиц.
Ключевые слова: наночастицы, микробный синтез, Shewanella oneidensis MR-1, сульфид серебра, ПЭМ, энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия.
В настоящее время активно ведутся исследования, посвященные «зеленому синтезу» наночастиц металлов и их соединений, перспективных для пр именения в различных технологических разработках. Бактерии, грибы и микроводоросли являются основными объектами данных исследований, так как они обладают природной способностью восстанавливать и окислять ряд различных субстратов и легко культивируются в промышленных масштабах [1,2]. В представленной работе был исследован микробный синтез наночастиц сульфида сереб -ра с помощью электрогенной, металлвосстанав-ливающей бактерии Shewanella oneidensis МЯ-1. Наночастицы сульфида серебра имеют высокий
потенциал для пр именения в оптоэлектронике и медицине. В силу своих полупроводниковых, оптоэлектрических свойств и высокой стабильности эти наночастицы могут использоваться при создании солнечных батарей, термоэлектрических датчиков, суперконденсаторов, как компонент твердых электролитов, полупроводниковых материалов, для осаждения Ag+ из растворов. Наночастицы сульфида сереб ра используют в биологической детекции как квантовые точки, при этом продемонстрирована возможность визуализации свечения наночастиц в кровеносном русле мышей in vivo [3]. Известно, что клетки S. oneidensis MR-1 способны восстанавливать широкий ряд субстра-
тов благодаря наличию разветвленной электрон-транспортной цепи, пер едающей электро -ны на клеточную поверхность [4,5]. В связи с этим штаммы 8Нв'№апе11а являются перспективными для использования в биотехнологии, в частности, для создания микробных топливных элементов и биор емедиации различных токсичных агентов [6,7], а также активно используются в исследованиях по биосинтезу наночастиц с помощью микроор ганизмов. С использованием этих бактерий были получены наночастицы золота, сульфида мышьяка, уранита, сульфида серебра [8-11].
Несмотря на многочисленные работы, посвященные синтезу наночастиц с помощью различных видов микроорганизмов, механизм образования наночастиц не исследован даже в общих чертах. Отсутствие таких знаний осложняет внедрение методов биосинтеза наночастиц в промышленное производство. Так, важным моментом для биотехнологического применения микробного синтеза наночастиц является возможность контроля и оптимизации процесса. Основной целью данной работы было исследование некоторых аспектов механизма синтеза наночастиц сульфида серебра клетками Shewanella.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штамм S. опе1ёет18 МИ-1 получен Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика из коллекции микроорганизмов Института Пасте-ра (№ С1Р106686, Франция).
Культивирование штамма Б. онеМен818 МИ-1. Штамм S. опе1ёет18 МИ-1 выращивали на чашках Петри на агаризованной среде Ьипа-ВеЛаш (ЬБЛ) при 30°С в течение 48 ч. Для получения биомассы клеток, колонии со среды ЬБЛ пе-рено сили в 100 мл бульона ЬВ в колбу объемом 750 мл и культивировали в аэробных условиях на кр уговой качалке пр и 220 об/мин при 30°С в течение 18 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, дважды отмывали стерильной деионизирован-ной водой МИН Q (МПНроге, США) пр и тех же условиях центрифугирования и р есуспензи-ровали в 2 мл деионизированной воды. Титр жизнеспособных клеток определяли, высевая на ср еду ЬБЛ клеточную суспензию в определенных разведениях.
Проведение реакции микробного синтеза наночастиц. Для получения наночастиц сульфида серебр а использовали свежепр иготовленный миллимолярный водный раствор солей азотнокислого серебр а и тиосульфата натрия (1 мМ
AgNO3:1 мМ Na2S2O35H2O). Суспензию клеток в объеме 1 мл переносили в 100 мл раствора солей в колбу объемом 750 мл и инкубировали полученный реакционный раствор на круговой качалке при 220 об/мин в течение 48 ч при температур е 30°С. Затем клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, супернатант фильтровали через стерильный фильтр с диаметром пор 200 нм (Nu^ 1еороге). Наночастицы из фильтрата суперна-танта о саждали с помощью высокоскоро стного центрифугир ования пр и 100000 g в течение 1
4, дважды отмывали деионизированной водой Milli Q с помощью высокоскор остного центрифугирования в тех же условиях. В контр ольном эксперименте в раствор солей не вносили клетки
5. oneidensis MR-1. Все остальные манипуляции с контрольным образцом проводили аналогично опытному образцу.
Обработка клеток S. oneidensis MR-1 ультразвуком. Разрушение клеток проводили с использованием ультразвукового дезинтегратора Soniprep 150 MSE (Англия) при амплитуде волны 12 микрон. Использовали зонд диаметром 9,5 мм, пригодный для работы с обр азцами до 50 мл. Объем клеточной суспензии составлял 5 мл. Титр клеток S. oneidensis MR-1 в суспензии составлял (1-5)-109 кл/мл. Обработку суспензии ультразвуком проводили трехкратно по 60 с, с интервалом в 180 с, на льду. Титр жизнеспособных клеток определяли, высевая на среду LBA обработанную ультразвуком клеточную суспензию в определенных разведениях.
Получение мембранной и бесклеточной фракций после ультразвуковой обработки клеток.
Разрушенные ультразвуком клетки центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант фильтровали через стерильный фильтр с диаметром пор 200 нм ^ис1еороге). Осадок отмывали однократно стер ильной деионизированной водой Milli Q, центрифугиро-вали, как описано выше для клеток, и ресус-пензировали в 2 мл деионизированной воды. Фильтрованный супернатант и осадок, содержащий клеточные структуры, использовали в дальнейшем для получения наночастиц.
Образование наночастиц в супернатанте, полученном прединкубацией клеток S. oneidensis MR-1 с тиосульфатом натрия. На пер вом этапе клетки инкубировали в 50 мл раствора тиосульфата натрия (2 мМ) в колбе объемом 750 мл на круговой качалке при 220 об/мин в течение 24 ч при температуре 30°С. Затем клетки осаждали из реакционного раствора центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, и супернатант фильтровали через стерильный фильтр с диаметром пор 200 нм (Nudeo-
pore). На втор ом этапе к фильтрату суперна-танта добавляли 50 мл раствор а нитр ата се-ребр а (2 мМ) и реакционную смесь инкубиро -вали в течение 24 ч в колбе объемом 750 мл на круговой качалке при 220 об/мин при температуре 30°C. Дальнейшее выделение наночастиц с использованием ультрацентрифугирования описано выше.
Анализ образцов методами аналитической просвечивающей электронной микроскопии. ПЭМ-анализ образцов реакционной смеси с на-ночастицами и выделенных наночастиц проводили пр и ускоряющем напряжении 200 кВ на аналитическом просвечивающем микроскопе JE0L2100 (JEOL, Япония) с катодом из гекса-борида лантана, оснащенном энергодисперсионным рентгеновским детектором X-Max (Oxford Instruments, Великобритания). Набор и обработку энер годисперсионных рентгеновских спектр ов проводили в прогр амме INCA (Oxford Instruments, Великобр итания). Регистрацию энергодисперсионных рентгеновских спектров проводили в диапазоне энергий рентгеновского излучения от 0 до 10 кэВ. Анализировали образцы как исходных реакционных смесей, так и отделенных от клеток и отмытых образцов наночастиц. Для приготовления ПЭМ-образцов 3 мкл реакционной смеси или выделенных наночастиц наносили на медную сеточку с подложкой из формвара, стабилизированного углеродом, либо дырчатого углерода с ультратонкой углеродной подложкой (Ted Pella, США) и высушивали на воздухе. ПЭМ высо -кого разрешения выделенных наночастиц про -водили на микро скопе JEM-2100F, (JEOL, Япония), оснащенном электронной пушкой с полевой эмиссией, а также корректором сферических аберраций.
Определение размеров наночастиц. Анализ размер ов частиц пр оводили с помощью про -граммного обеспечения для
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.