БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.6, c.1057-1062
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 576.311.347
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЭТАНОЛА НА СИНТЕЗ СЕРИНА И ОБМЕН МЕТИЛЬНЫХ ГРУПП В ГЕПАТОЦИТАХ МЕТОДОМ ЯМ Р-СПЕКТР ОСКОПИИ
© 2010 г. Э.Л. Холмухамедов*, В.В. Теплова, К.Б. Джонсон**, Д. МакДоналд**
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, ПущиноМосковской области; *Center for Cell Death, Injury and Regeneration, Department of Ркагтасеыйса1 and Biomedwal Sdernes, Medial University of South Carolina, Charleston, SC USA; **Department of Biomedwal Engineering, University of North Carolina, NC USA Поступила в p едакцию 12.08.10 г.
Методом ЯМР-спектр о скопии исследована роль потенциал-зависимых анионных каналов внешней мембр аны митохондр ий пр и действии этанола на синтез серина и обмен метильных групп в гепатоцитах. Предложен методологический подход, позволяющий проводить независимый мониторинг синтеза серина в цитоплазме и в митохондриях интактных клеток и их количественную оценку в одном и т^м же экстр акте клеток путем опр еделения профиля изотопомер ов серина, синтезир ованных из C-меченного глицина. Выявлено изменение ур овня изотопомер ов серина под действием этанола и цистеамина, ингибитора митохондр иального синтеза сер ина. Сделан вывод о том, что наблюдаемое при действии этанола на гепатоциты уменьшение синтеза всех изотопомеров серина может быть обусловлено не только закрыванием пориновых каналов и подавлением обмена субстр атов синтеза серина в митохондриях, но и восстановлением цитоплазматического и/или митохондриального пула пиридиновых нуклеотидов при окислении этанола. Получена новая информация о механизме действия этанола (алкогольной интоксикации) на метаболизм глицина, что открывает новые перспективы в лечении последствий алкогольного отравления.
Ключевые слова: этанол, метаболизм глицина, изотопомеры серина, пориновые каналы, ЯМР-спектроскопия.
Патогенез заболеваний печени вследствие алкогольного отравления остается неизвестным, и множество различных факторов оказываются вовлеченными в потер ю печенью о сновных функций. Алкогольное отравление печени приводит к снижению способности клеток к защите от окислительного стресса, к нарушению не только сопряжения между глюконеогенезом и уреагенезом, но и обмена метильными группами между цитоплазмой и матр иксом [1-5]. Действие этанола вызывает существенные изменения в серин-зависимых реакциях трансметилирования метионина, снижает уровень Б-аденозилметио-нина и повышает уровень гомоцистеина в плазме [6-8]. Полученные в последние годы данные о действии этанола на функции печени показывают, что гепатотоксичность этанола в первую очередь обусловлена потерей митохондри-альных функций, приводящей к значительным нарушениям во всем клеточном метаболизме
Сокращения: ФБС - фетальная бычья сыворотка, Ф СБ -фосфатно-солевой буфер, THF - тетрагидрофолат, SHMT -серингидроксиметилтрансфераза.
[9-14]. 70% общей клеточной активности фермента серингидроксиметилтрансферазы, о суще-ствляющей перенос метильной группы от молекулы глицина на молекулу серина, опр еделя-ется в митохондриях, что указывает на их ключевую роль в метаболизме глицина и обмене метильных групп [15,16]. Транспорт субстратов метаболизма метильных групп (в том числе глицина и серина) через внутр еннюю мембрану митохондрий осуществляется с помощью специфических переносчиков [17-19], а через внешнюю митохондриальную мембрану происходит через открытые пориновые каналы [20-22]. В последние годы установлено, что при определенных условиях проницаемость внешней мембраны митохондрий уменьшается, что приводит к блокированию обмена метаболитов, вследствие закрывания пориновых каналов [23-26]. Дефицит метильных групп, наблюдаемый при чрезмерном употреблении алкоголя, может быть обусловлен снижением производства се-рина в митохондриях и нарушением обмена метильных групп в гепатоцитах вследствие за-
крывания пориновых каналов внешней мито-хондриальной мембр аны.
Целью настоящей работы являлось исследование действия этанола на синтез серина и обмен метильных групп в гепатоцитах. C помощью количественной 13С-ЯМР-спектроско-пии показано, что этанол существенно подавляет митохондриальный синтез серина, основного донора метильных групп в метаболизме метионина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение и культивирование гепатоцитов.
Гепатоциты выделяли из печени крыс линии Sprague-Dawley фер ментативным способом с использованием коллагеназы (0,1 мг/мл, Sigma, США) по методике, описанной в работах [2,27]. Для исследования метаболизма 13С-меченного глицина с помощью позиционной ядерной магнитной спектроскопии (13С-ЯМР) гепатоциты (25-106 клеток/мл) инкубировали в ср еде DMEM с высоким уровнем глюкозы, дополненной 2 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата, 10% феталь-ной бычьей сывор отки (ФБС), 100 U пенициллина/стрептомицина, 140 нМ инсулина и 1 мкМ дексаметазона. Аликвоту клеток (10 мл) переносили в 145 см2 чашки Петри (Nundon, Киис 1пс, США), предва рительно покрытые 0,1% коллагеном из хвостов крыс, р астворенном в 0,1%-й уксусной кислоте, как описано в работах [22,28]. Спустя 1-2 ч после переноса клеток в чашки Петр и, среда инкубации, содер жавшая мертвые и не прикрепившиеся клетки, была заменена на свежую. После 60 мин инкубации аликвота 213-С-меченного глицина (Кембриджская лаборатория изотопов, MA США) была добавлена к ср еде инкубации в конечной концентрации 5 мМ.
Получение образцов для ЯМР-епектроеко-
пии. Цитозольная фракция для ЯМР-спектроско-пии была получена путем экстракции гепатоци-тов смесью метанол-хлороформ-вода (1:1:1). После промывки ледяным фосфатным буфером к клеткам добавляли 5 мл охлажденного метанола, и экстракт переносили в стеклянные флаконы. К экстрактам приливали 5 мл охлажденного хлороформа и 5 мл дистиллированной воды, флаконы энергично встряхивали в течение 10 мин. Метанол-хлороформ-водный экстракт хранили 12-14 часов при температуре 4°С, и после ра сслоения смеси, верхнюю метанол-водную фракцию, содержащую водорастворимые компоненты цитоплазмы, отбирали для пр оведения 13С-ЯМР-спектро скопии. Метанол-водные экстракты гепатоцитов высушивали в вакууме и хранили при 4°С перед 13С-ЯМР-спектроскопией.
ЯМР-епектроекопия. Высушенные экстракты были растворены в 700 мкл окиси дейтер ия ^2О), содержащей 1 мМ водорастворимой соли 2,2,3,3,-тетрадейтерио-3-триметилсилил-пропионата натрия (^Р) в качестве внутреннего калибровочного стандарта для количественного анализа 1Н-ЯМР-спектров, и 3 мМ 213С-меченного ацетата, в качестве внутреннего калибровочного стандарта для количественного анализа 13С-ЯМР-спектров. Образцы тщательно перемешивали до полного растворения всех гранул и центрифугировали для удаления нерас-творившихся примесей. Супернатанты переносили в специальные 5 мм трубки (ампулы) для получения ЯМР-спектров. 13С-ЯМР-спектры были получены на ЯМР-спектрофотометре 11.7T (500 МГц) Varian IN OVA (Varian 1пс., США), настроенном следующим образом: спектральная ширина - 32 кГц, комплексных точек - 64000, задержка перед 90-градусным импульсом - 2 с, число накоплений - 640, с использованием широкополосного подавления протонов. Все спектры были проанализированы с использованием программы 1D-ACD (ACD Labs, Канада). 13С-меченный глицин, D2О и агенты для калибровки датчиков ЯМР-спектрофотометра были получены из Кембриджской лаборатории изотопов (Cambridge Laboratories, MA СШA).
Статистический анализ полученных данных проводили с помощью стандартного г-теста Стьюдента и программы для анализа вариаций (ANOVA), при использовании в качестве показателя достоверности наблюдаемых различий p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования действия этанола на синтез серина и обмен метильных групп в гепатоцитах использовали методологический подход, позволяющий проводить раздельный мониторинг синтеза серина в цитоплазме и в митохондриях при помощи позиционной ядерной спектроскопии. Основным источником ме-тильных групп для восстановления метионина в клетках являются молекулы серина, синтез которых из глицина происходит в двух раздельных компартментах (цитозоле и митохондриях) и протекает с участием различных метаболических систем [19,29-32]. Перенос ме-тильной группы от молекулы глицина на молекулу серина катализируется серингидрокси-метилтрансферазой (SHMT), ферментом, который присутствует как в цитоплазме, так и в матриксе митохондрий. Однако с помощью 13С-меченного глицина было обнаружено, что при метаболизме глицина в митохондриях и в ци-
И ССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙ C ТВИЯ ЭТАНОЛА НА C ИНТЕЗ СЕРИНА
1059
Pис. 1. Схема цитозольного пути синтеза серина, демонстрирующая образование 213С-изотопомера сер ина из 213С-глицина. c-SHMT - цитоплазмати-ческая сер ингидр оксиметилтр ансфер аза; THF - молекулы тетрагидрофолата; 5,10-метил-THF - ме-тилтер агидр офолат, поставщик метильных групп у млекопитающих.
тозоле формируются pазличные изотопомеры сер ина (молекулы, содержащие 13С в тр ех р аз-ных позициях). В клетках печени молекулы глицина транспортируются через цитоплазма-тическую мембрану вместе с ионами натрия в цитозоль и далее в митохондр ии. Синтез сер ина в цитоплазме катализируется цитоплазматиче-ской с-SHMT и образуется из глицина при пер ено се метильной группы глицина на молекулы тетр агидр офолата (THF) с обр азованием метилтетр агидр офолата (5,10-CH2-THF), поставщика метильных групп у млекопитающих [33-35]. При этом из молекул 213С-глицина, содержащих атом 13С в положении «2», будет обр азовываться один изотопомер сер ина - 213С-сер ин (р ис. 1). Митохондр иальный путь синтеза, все реакции и ферментные системы которого локализованы в матр иксе митохондр ий, пр ин-ципиально отличается от цитоплазматического пути наличием уникальной системы реакций расщепления глицина, получившей название Glytine Cleavage System (GCS). Эта система расщепления глицина включает в себя четыре независимые реакции, которые обеспечивают расщепление глицина и синтез изотопомеров сер ина, хар актер ных только для митохондр ий [17-19]. Эта последовательность реакций показана на рис. 2. Как видно на схеме, на начальном этапе молекула глицина подверга
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.