БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.5, c.894-900
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3: 612.275.1: 612.821.6
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ ЭПР ВЛИЯНИЯ ГИПОКСИИ НА ОБРАЗОВАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В КРОВИ КРЫС ЛИНИИ КР УШИНСКОГО-МОЛОДКИНОЙ
© 2009 г. Л.М. Байдер, В.П. Реутов*, А.Л. Крушинский**, В.С. Кузенков**, Е.Г. Сорокина***, В.Б. Кошелев****, О.Е. Фадюкова****, Т.Т. Жумабаева, Т.А. Лозинова, Л.Х. Комиссарова, В.Г. Пинелис***, Н.С. Косицын*, З.В. Куроптева
Институт биохимической физики РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4;
*
Институт высшей нервной деятельности РАН, 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а;
**
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119899, Москва, Воробьевы горы; ***НЦЗДРАМН,119991, Ломоносовский пр., 2;
****
Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119899, Москва, Воробьевы горы Поступила в p едакцию 09.12.08 г.
Методом ЭПР исследовано влияние гипоксии на образование оксида азота в крови крыс линии Крушинского-Молодкиной. Показано, что в кр ови этих крыс идет повышенный по сравнению с крысами Wistar синтез оксида азота. Получены данные, свидетельствующие о том, что гипоксия, вызванная подъемом кр ыс линии К рушинского-Молодкиной на высоту 5000 м, сопр овождается увеличением интенсивности сигнала ЭП Р комплексов гемоглобина с оксидом азота в крови животных. В настоящее вр емя нельзя ответить на вопрос, каковы все возможные пути увеличения оксида азота в условиях гипоксии. Однако на о сновании полученных данных можно пр едположить, что в условиях гипоксии активируются как NO-синтазная, так и нитро- и нитритредуктазная системы, участвующие в образовании NO и Hb-NO-ком-плексов.
Ключевые слова: гипоксия, оксид азота, NO-синтазные, нитроредуктазные, нитритредуктазные системы, Hb-NO комплексы, ЭПР.
В последние два десятилетия опубликовано большое число работ, посвященных анализу роли оксида азота (N0) в физиологических [1-4] и патофизиологических [3,5—7] процессах. Интерес физиологов и врачей к N0 в значительной степени обусловлен разнообразием его функций в организме [6,8—10]. Оксид азота в условиях нормального функционирования нервной системы участвует в синаптической передаче и формировании длительной постсинап-тической потенциации, выполняет р оль активного вазодилататора и способствует выделению нейромедиаторов [1,3,9,11]. Однако известны данные о том, что N0 может быть одним из факторов повреждения и гибели нейронов при нарушениях мозгового кровообращения, ишемии мозга и судор ожных состояниях, сопровождающихся повышенным выделением глутама-та в синаптическую щель [1,2,12—22]. Двойст-
Сокращения: NO - оксид азота, Hb-NO-комплексы -комплексы гемоглобина с оксидом азота.
венная роль N0 в ишемической патологии мозга и эпилептиформных судо рожных состояниях определяется целым рядом факторов, среди которых выделяют активность конститутивных и индуцибельных N0-cинтаз, концентрацию N0 и продуктов его превращения, интенсивность кислородного голодания, стадию развития ише-мического поражения нейронов мозга и ряд других факторов [1—5,16—20,23—26]. В настоящее вр емя далеко не всегда можно указать случаи, когда для предупреждения ишемического повреждения мозга следует использовать N0-^-нер ирующие соединения или ингибитор ы N0-синтаз [5,6,11,21].
Известно также, что оксид азота и продукты его метаболизма способны участвовать в циклических взаимопревращениях [12,13,27]. Благодаря этому не только Ь-аргинин может служить субстратом для образования N0, но и, например, ионы N02— могут восстанавливаться до N0 в результате акцептир ования электр онов с гемсодержащих белков, находящихся в дезок-
си-форме [19,24,28]. Поскольку при гипоксиях различного генеза увеличивается вероятность пер ехода гемсодержащих белков в дезокси-фор-му, необходимо учитывать не только роль N0-синтаз в образовании оксида азота, но и другие механизмы, в которых возможна регенерация N0 из различных нитро- или нитрозосоедине-ний.
Ранее нами на модели аудиогенного эпи-лептиморфного припадка (на крысах линии Крушинского-Молодкиной) было исследовано влияние Ь-а ргинина, N0-генеpиpующего соединения (NaN02) и ингибитора N0-cинтазы -нитро-Ь-аргинина (L-NNA) на развитие стрес-сорных повреждений (смертность, двигательные нарушения, внутричерепные кровоизлияния), возникающих в результате акустического воздействия [5,6,20,23,26]. Установлено, что ^N02 в дозе 0,5 мг/100 г оказывает значительное защитное действие при развитии стрессорных повреждений у крыс в условиях акустической экспозиции [23,26]. L-NNA во всех изученных дозах, наоборот, усиливал стр ессорные повреждения, возникающие в результате акустического воздействия [5]. При одновременном введении L-NNA в дозах 0,25 мг/100 г или 2,5 мг/100 г и нитрита натрия в дозе 0,5 мг/100 г наблюдали общее снижение стрессор ных повреждений, вызванных ингибированием N0-^^ тазы в условиях акустической экспозиции у крыс линии К рушинского-Молодкиной [5,20,23,26]. Защитное действие также оказывал и Ь-аргинин [6]. Полученные данные позволяли высказать пр едположение о том, что оксид азота может выполнять функцию антистрессорного физиологически активного вещества в организме крыс линии Крушинского-Молодкиной в условиях акустической экспозиции.
Целью настоящей работы явилось исследование методом ЭП Р влияния гипоксии на образование оксида азота в крови крыс линии К рушинского-Молодкиной, а также влияние на процесс генерации N0 в условиях гипоксии ингибитора N0-cинтазы - L-NNA и нитрита натрия при раздельном и одновр еменном введении этих соединений в организм животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы 42 крысы линии Крушинского-Молодкиной (самцы в возрасте 5-6 мес., массой 280-320 г). Было поставлено семь серий экспериментов по шесть животных в каждом эксперименте: 1 - контроль, при котором животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор; 2 - опыт с «подъемом на высоту 5000 м» (гипоксия) жи-
вотных, которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор; 3 - опыт с введением L-NNA в физиологическом растворе; 4 - опыт с введением L-NNA в физиологическом раствор е + гипоксия; 5 - опыт с введение NaN02 в физиологическом растворе; 6 - опыт с введением NaN02 в физиологическом р а створ е + гипоксия; 7 - опыт с совместным действием: введением ^N02 + L-NNA в физиологическом растворе + гипоксия.
Нитрит натр ия в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела, а также L-NNA в дозе 2,5 мг на 100 г массы тела вводили внутрибрюшинно. В других сериях экспериментов осуществляли одновременное введение L-NNA и нитрита натрия в тех же дозах. Контрольным крысам, как указывалось выше, вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Все экспериментальные воздействия с введением NaN02 и L-NNA, а также моделирование «подъема на высоту 5000 м» осуществляли в течение 60 мин, после чего животных декапитировали, а кровь и ткани использовали для приготовления образцов для ЭПР-исследования.
Спектр ы ЭП Р крови и тканей регистрировали при температуре 77 К на ЭПР-спектро-метре ЕБР300 фирмы Бгикег. Во избежание эффектов насыщения сигналы ЭП Р образцов тканей записывали пр и мощности СВЧ 20 мВт, а амплитуда ВЧ-модуляции (100 кГц) магнитного поля равнялась 5 Гс. Интенсивность сигнала парамагнитных комплексов оксида азота с гемоглобином (НЬ^0) определяли в относительных единицах по величине амплитуды первой компоненты триплетного сигнала ЭПР, что пропорционально количеству комплексов НЬ-N0 в образце [7,10,25].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 приведены спектры ЭПР крови крыс линии К рушинского-Молодкиной в контр оле (без каких-либо воздействий) - (рис. 1, кривая 1) и после воздействия гипоксии (рис. 1, кривая 2). Наблюдаемый сигнал обусловлен суперпозицией двух сигналов ЭПР: сигнала ЭПР плазменного белка церулоплазмина с g-фактором 2,05 (рис. 1, кривая 3) и сигнала нитрозильных комплексов НЬ-К0 - широкий сигнал с триплетным расщеплением пр и g = 2,01, хар актерным для Т-конфор меров гемоглобина. Из-за перекрывания этих двух сигналов, сравнимых по интенсивности, наблюдаемые спектры ЭП Р имеют несколько необычный вид. Для интерпретации набюдаемых на рис. 1 (кривые 1 и 2) сигналов была проведена реконструкция спектров.
Рис. 1. Спектры ЭПР образцов крови крыс линии Крушинского-Молодкиной: 1 - в контроле; 2 -после «подъема» на высоту 5000 м и рекон струкция спектров; 3 - сигнал ЭПР церулоплазмина; 4 -сигнал НК ИЪ-МО в кр ови в условиях гипоксии после введения нитрита натрия в дозе 4 мг/г веса животного (усиление при регистрации этого сигнала было в 16 р аз меньше, чем пр и регистр ации сигналов 1 и 2), 5 - экспериментальный спектр, р егистр ир уемый в кр ови животных после «подъема на высоту» (аналог спектр а 2), котор ый, как можно видеть, хорошо совпадает с реконструированным спектр ом 6, 6 - р еконструир ованный ЭП Р спектр, в котор ом доли сигналов ЭП Р церулоплазмина (рис. 1,3) и НК ИЪ-МО (рис. 1,4) составляют 30 и 70% соответственно.
Р ис. 2. Изменение содер жания ИЪ-МО комплексов в семи экспериментальных вариантах: без введения МаМО2 (1-4) и на фоне введения 0,5 мг/100 г массы тела МаМО2 (5-7): 1 - контроль; 2 - после «подъема животных» на высоту 5000 м (гипоксия); 3 - на фоне введения ингибитор а МО-синтазы Ь-ММЛ (2,5 мг/100 г массы тела); 4 - на фоне введения ингибитор а МО-синтазы Ь-ММЛ (2,5 мг/100 г массы тела) «подъем» на высоту 5000 м; 5 - на фоне введения МаМО2 (0,5 мг/100 г ма ссы тела); 6 - на фоне введения МаМО2 (0,5 мг/100 г массы тела) «подъем» на высоту 5000 м; 7 - на фоне введения ингибитор а МО-синтазы Ь-ММЛ (2,5 мг/100 г массы тела) и введения МаМО2 (0,5 мг/100 г массы тела) «подъем» на высоту 5000 м. Более подробно описание этих экспер иментальных вар иантов пр ед ставлено в методике эксперимента. Врезка - более детальное пр едставление вар иантов (1-4) без введения МаМО2. Звездочками обозначено: ** р < 0,05.
Количественная оценка вклада индивидуальных сигналов в регистр ируемые суммар ные спектр ы ЭП Р пр оводилась с помощью пр огр ам-мы компьютер ного моделир ования сигналов в функциональном пр о стр анстве
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.