БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с. 1014-1018
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 5 77.359:5 7.08 7:576.08
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
КЛЕТОК КРОВИ
© 2008 г. М.З. Федорова, Н.А. Павлов, Е.В. Зубарева, С.В. Надеждин, В.В. Симонов,
Н.А. Забиняков, Е.С. Тверитина
Белгородский государственный университет, 308015, Белгород, ул. Победы, 85
E-mail: Fedorova@bsu.edu.ru Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Показаны возможности использования атомно-силовой микроскопии для оценки геометрических характеристик клеток крови. На основе сопоставления морфометрических показателей гемоцитов, полученных при разных режимах сканирования, установлено, что бесконтактный и полуконтактный методы являются адекватными для изучения размеров и геометрической формы биологических объектов. Сканирование клеток в контактном режиме приводит к необратимой деформации образцов.
Ключевые слова: клетки крови, морфометрические показатели, атомно-силовая микроскопия.
Известно, что клетки различных организмов - от бактерий до млекопитающих - способны к регуляции объема [1]. В объемную регуляцию вовлечены различные системы внутриклеточной сигнализации [2-6]. Лейкоциты крови высших животных и человека имеют излишек мембранного резерва, существующий в виде складчатости и расширений различной формы [7,8]. Мембранный резерв участвует в реализации специфических видов клеточной подвижности, таких как локомоции и деформации. Методами световой микроскопии, с использованием функциональных проб в виде гипоосмотических нагрузок или аспирации в микропипетку, получены данные о возможности изменений объема лейкоцитов и величине мембранного резерва
[9,10].
Нерешенность многих проблем, касающихся специфических реакций белых клеток крови, и функциональная значимость ауторегуляции объема актуализируют поиски точных и чувствительных методов оценки объема гемоцитов. Одним из перспективных методов изучения морфофункциональной организации клеток в настоящее время становится атомно-силовая микроскопия (ACM). C использованием АСМ получены данные об изменениях эластичных и вязкоэластичных свойств клеток соединительной и эпителиальной тканей [11-17], проведены исследования по изучению морфологии лейко-
Сокращение: АСМ - атомно-силовая микроскопия.
цитов крови человека [18,19]. В связи c существенными различиями морфологических параметров одних и тех же клеточных пулов, фиксированных разными способами, некоторые авторы [18,19] считают нецелесообразным применять методы ACM при изучении размеров клеток.
Целью настоящей работы было изучение возможности использования ACM для оценки морфометрических параметров клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на лимфоцитах лабораторных белых крыс и эритроцитах птицы (курица домашняя). Кровь получали путем дека-питации у предварительно наркотизированных животных. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в количестве 20 ед./мл. Кровь крысы центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин, собирали нижнюю часть плазмы, богатую лейкоцитами, и лейкоцитарное кольцо. Примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония. Клетки дважды отмывали изотоничным буферным раствором (раствор Дульбекко, рН 7,4). Эритроциты птиц также отмывали и ресуспендировали в изото-ничном буферном растворе. Фиксацию клеток проводили 2% раствором глутарового альдегида (Merck, Германия).
Использовали аппаратно-программный комплекс Видео-ТесТ (Санкт-Петербург) с микроскопом Ахюз1аг р1ш (Carl Zeiss, Германия) и
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
1015
ч
1-е 3
: ■■;';•■ mode UV WD mag HFW tilt j-pm-■
BidliSE 1000 fcV 98inrr 1200C x 12.5 lim 10
Рис. 1. Лимфоцит крови крысы, фиксированный в суспензии глутаровым альдегидом. Сканирование выполнено в режиме низкого вакуума.
программой Видео-ТесТ-Размер 5.0; сканирующий электронный микроскоп Quanta 200 3D (FEI, США) в режиме низкого вакуума; атом-но-силовой микроскоп «ИНТЕГРА Вита» (НТ МДТ, Зеленоград). Зондирование образцов осуществляли в однопроходном режиме, контактным, полуконтактным и бесконтактным методами. Для контактного метода использовали кантилеверы марки НА_С1, полуконтактного и бесконтактного - NSG 03 (НТ МДТ). Обработку полученных результатов проводили при помощи программного обеспечения Nova 1.0.26 Build 1397 (НТ МДТ).
Объем клеток рассчитывали по стандартным формулам для эллипсоидных тел: V = 4/3 (nabo), где V - объем, a, b, c - большая, средняя и малая полуоси соответственно. Коэффициент уплощенности клеток вычисляли как отношение площади эллипса (проекция гемо-цитов в плоскости длинных осей) к их высоте. Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стьюдента.
Исследования на электронном и зондовом сканирующем микроскопах выполнены в центре коллективного пользования Белгородского государственного университета.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В предварительной серии опытов получены результаты о влиянии глутарового альдегида на размеры лимфоцитов крови крыс. Значения диаметра живых клеток составляли 8,7 ± 0,1
Таблица 1. Морфометрические характеристики лимфоцитов при разных способах измерений
Изме-
Способ измерения ряемый пара- Клетки, фиксированные Клетки, фиксированные в
метр, мкм в мазке суспензии
Световая микроскопия D 6,46 ± 0,1 5,51 ± 0,1* (88)
Атомно-си- D 9,48 ± 0,5** 6,68 ± 0,3* **
ловая мик-
роскопия (контакт- H 0,92 ± 0,05 1,87 ± 0,19*
ный ре- (44) (42)
жим)
Примечание: D - диаметр, H - высота. В скобках - объем клеток, мкм3. * - Достоверность различий по сравнению с клетками в мазке по критерию Стьюдента (p < 0,01). ** - Достоверность различий по сравнению с результатами измерений на световом микроскопе по критерию Стью-дента (p < 0,01).
мкм; фиксированных - 5,9 ± 0,1 мкм. Различия в размере составляют 32%, что совпадает с полученными ранее данными [20] и объясняется сморщиванием клеток при добавлении глутарового альдегида в суспензию лимфоцитов до концентрации 2% (дополнительная осмоляр-ность 180 мо смоль) [21,22].
Во второй серии опытов суспензия лимфоцитов была разделена на две части. Первую часть использовали для изготовления мазков, которые после подсыхания фиксировали 2% раствором глутарового альдегида. Фиксацию второй части проводили добавлением в клеточную взвесь глутарового альдегида до конечной концентрации 2%. Фиксированные клетки помещали на стекло. Результаты измерений, полученные с использованием светового и атомно-силового микроскопов, представлены в табл. 1. Различия в линейных размерах клеток более выражены при использовании АСМ (29,5%), чем при использовании светового микроскопа (14,7%). В присутствии глутарового альдегида сохраняется прижизненная, близкая к шаровидной, форма клеток, что позволило рассчитать объем клеток, фиксированных в суспензии и измеренных на световом микроскопе. Его значения более чем в два раза превышали данные, полученные с использованием АСМ (табл. 1). При этом объем лимфоцитов, распластанных на стекле (мазок) и фиксированных в суспензии, был практически одинаковым, хотя форма клеток существенно отличалась от шаровидной.
1016
ФЕДОРОВА и др.
^ П\ ( * \ i
I Л В^
Щ j V i
Рис. 2. Эритроциты крови птиц, фиксированные в суспензии глутаровым альдегидом и помещенные в камеру Горяева. Неокрашенный препарат. х400; а - положение клетки «плашмя»; б - положение клетки «ребром».
Рис. 3. Лимфоцит крови крысы. Сканирование одной и той же клетки на АСМ осуществлялось последовательно разными методами: (а) - полуконтактным; (б) - контактным. Видна значительная разница между вертикальными размерами клетки.
Одной из возможных причин данного явления могло быть «прижимание» (деформирование) клеток зондом кантилевера. Для проверки данного предположения было выполнено аналогичное исследование на эритроцитах курицы домашней, которые имеют форму уплощенных эллипсоидов небольшого размера. Использовали клетки, фиксированные в суспензии глутаровым альдегидом. Часть из них помещали в камеру Горяева и слегка перемещали ее на предметном столике микроскопа, что приводи-
Таблица 2. Морфометрические характеристики эритроцитов курицы домашней при разных способах измерений
Способ измерения
Измеряемый параметр, мкм Световая микроскопия Атомно-силовая микроскопия (контактный режим)
Длина 7,12 ± 0,08 10,01 ± 0,09*
Ширина 4,05 ± 0,05 6,29 ± 0,12 *
Высота 2,40 ± 0,04 (37,26 ± 1,4) 2,19 ± 0,06 * (70,29 ± 3,1*)
Примечание. * - Достоверность различий по сравнению с результатами измерений на световом микроскопе по критерию Стьюдента (р < 0,01). В скобках - объем клеток, мкм3.
ло к «кувырканию» эритроцитов. Делали несколько фотоснимков и измеряли три параметра эритроцитов (длину, ширину и высоту) с помощью программы «Видео-Тест-Размер 5.0» (рис. 2). Другую часть клеток сканировали на АСМ. Результаты измерений представлены в табл. 2. Как и в предыдущей серии, сканирование эритроцитов в контактном режиме приводило к их «прижиманию»: существенно увеличивались длинные оси (длина, ширина) и уменьшалась короткая (высота). Коэффициент уплощенности для эритроцитов, рассчитанный на основе измерений в световом микроскопе, составил 9,4; на АСМ - 22,6. «Уплощение» примерно того же порядка зарегистрировано и для лимфоцитов (табл. 1). Пересчет на объем эритроцитов птицы также давал почти двукратные различия. Результаты исследований клеток, проведенных в контактном режиме сканирования, показали, что даже при использовании «мягких» кантилеверов происходит деформация биологических объектов из-за непосредственного касания острием зонда поверхности образца. При этом форма и размеры скана могут значительно отличаться от «оригинала». В зависимости от исходной геометрической формы гемоцитов искажение может приводить к занижению или завышению рассчитываемого параметра (объема). Для решения поставленной задачи была проведена серия исследований с последовательным зондированием клеток разными методами. Первый вариант: одни и те же клетки сначала сканировали в контактном, а
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОИ МИКРОСКОПИИ
1017
Таблица 3. Морфометрические характеристики лимфоцитов при разных р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.