ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 1, с. 37-43
УДК 577.151.05;577.111.3
ИДЕНТИФИКАЦИЯ 2',3'-cGMP КАК ИНТЕРМЕДИАТА КАТАЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ РНК БИНАЗОЙ И ОЦЕНКА ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
© 2015 г. Ю. В. Сокуренко*, П. В. Зеленихин*, #, В. В. Ульянова*, А. И. Колпаков*,
Д. Мюллер**, О. Н. Ильинская*
*Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Республика Татарстан, Казань, ул. Кремлевская, 18 **Institute for Anatomy and Cell Biology Justus-Liebig-University, 35385 Giessen, Germany Поступила в редакцию 05.05.2014 г. Принята к печати 03.07.2014 г.
Биназа — РНКаза Bacillus pumilus (ранее B. intermedius), — эндонуклеаза, которая деполимеризует РНК, расщепляя 3',5'-фосфодиэфирную связь между гуанозин-З'-фосфатом и 5'-ОН-группой соседнего нуклеотида с образованием 2',3'- гуанозинциклофосфатов в первом этапе каталитической реакции. Последующий гидролиз образующихся 2',3'-сОМР до З'-фосфата высокоспецифичен и осуществляется медленно, в связи с чем возникает вопрос о времени существования данного позиционного изомера при каталитическом расщеплении РНК биназой и о его вкладе в противоопухолевую активность последней. В настоящей работе с помощью иммуноферментного анализа установлено, что при расщеплении РНК биназой 2',3'-сОМР сохраняется в реакционной смеси в течение часа, при этом действие фосфодиэстраз не приводит к полной его элиминации. Количество 2',3'-сОМР максимально при рН 8.5 и достигает наномолярных концентраций при исходной концентрации РНК 100—1000 мкг/мл. Экзогенный 2',3'-сОМР, как и его позиционный изомер 3',5'-сОМР, не вызывают апоптоз клеток аденокарцино-мы легких человека А549, подверженных апоптогенному действию биназы. Учитывая данные об интернализации биназы и активации открытия митохондриальных пор 2',3'- гуанозинциклофосфа-тами, можно предположить, что в апоптоз, индуцированный биназой, 2',3'-сОМР, способен внести вклад только при внутриклеточном его образовании.
Ключевые слова: циклизующие гуанилспецифичные РНКазы, биназа, 2',3'-сGMP, карцинома легких человека А549.
DOI: 10.7868/S0132342315010133
ВВЕДЕНИЕ
Семейство Т1-рибонуклеаз (РНКаз) (КФ 3.1.27.3) включает около 25 низкомолекулярных внеклеточных белков бактерий и грибов, сходных по первичным аминокислотным последовательностям и третичной структуре [1]. Эти ферменты деполиме-ризуют полирибонуклеотиды (или дезаминирован-ную РНК), расщепляя 3',5'-фосфодиэфирную связь между гуанозин-З'-фосфатом (или З'-фосфатами инозина, ксантозина) и 5'-ОН-группой соседнего нуклеотида с образованием 2',3'-гуанозинцикло-фосфатов в первом этапе каталитической реакции. Данный этап является обратимым и гораздо более быстрым, чем второй, в котором циклический интермедиат гидролизуется до соответству-
Сокращения: сОМР — гуанозинциклофосфат, ФДЭ — фос-фодиэстераза; сКР-аза — 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфо-диэстераза.
#Автор для связи (тел.: +7 (843) 233-78-84; факс: +7 (843) 233-78-14; эл. почта: pasha_mic@mail.ru).
ющего 3'-фосфата [2]. РНКазы Т1 гуанилспеци-фичны и во второй стадии катализа могут расщеплять исключительно 2',3'-сОМР [3]. Аналогичный механизм действия имеют ферменты семейства панкреатической РНКазы А (КФ 3.1.27.5), однако, в отличие от РНКаз Т1, второй этап их каталитического действия специфичен по отношению к пиримидиновым нуклеотидам с терминальными 2',3'-гуанозинциклофосфатами [4].
Биназа—РНКаза Bacillus pumilus (устаревшее название вида — B. intermedius) [5], относится к Т1-РНКазам. В ее активном центре преимущественно связываются гуанозин и его фосфорилированные производные (ОМР, ОЭР, ОТР) [3]. Один из каталитических остатков, His-101, локализован на подвижной петле, а другой (Glu-72) расположен в бета-структуре белка; частью сайта узнавания гуани-новых оснований в молекуле биназы являются соответственно остатки Phe-55 и Tyr-102 [6]. Му-тантные формы биназы с заменами гистидина в ак-
38
СОКУРЕНКО и др.
100
200 500 1000
Концентрация РНК, мкг/мл
« л
Я Си' н
а ¥
Й 1*1
А
¿1
А
А
0.2 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0 15.0 30.0 60.0 Время реакции, мин
6 5 4 3 2 1 0
5.0 7.0 8.0 8.5 9.0 10.0
рН, единицы
Рис. 1. Продукция 2',3'-сОМР биназой при 37°С в зависимости: от концентрации РНК в реакционной смеси (рН 8.5, время инкубации 15 мин) (а); от рН (РНК 1000 мкг/мл, время инкубации 15 мин) (б); от времени инкубации (РНК 1000 мкг/мл, рН 8.5 (в). Концентрация биназы 10 (светлые столбцы) и 100 мкг/мл (темные столбцы).
тивном центре (НЫ01А5П и Шз101ТЬг) сохраняют способность к реакции трансэтерификации, но не способны гидролизовать образующийся гу-анозинциклофосфат [7]. Хотя большинство известных РНКаз способны осуществлять оба этапа каталитической реакции, у В. зыЬИШ обнаружены отдельные ферменты, катализирующие деградацию РНК (Уиг1) и 2',3'-циклических нуклеотидов (У&М) как субстратов, образованных Уиг1 [8].
Обращает на себя внимание то, что первый этап гидролиза РНК малоспецифичен и может быть осуществлен РНКазами, не обладающими свойством расщеплять 2',3'- циклические нуклео-тиды; кроме того, скорость реакции циклизации
выше, чем реакции расщепления цикла [2]. Это предполагает присутствие в реакционной смеси некоторого количества 2',3'-циклических нуклеотидов, часть из которых в случае расщепления последовательностей РНК с повторяющимися основаниями будут свободными, не связанными с 3'-концом олигонуклеотидных фрагментов. Хро-матографический анализ продуктов гидролиза полиаденилата альфа-сарцином выявил в реакционной смеси наличие полиадениловых олигонук-леотидов, аденина, 3'-АМР и сАМР [9], причем последнее соединение, как и для всех Т1-РНКаз, представляет собой 2',3'-циклический изомер. Вероятно, биназа при гидролизе РНК также может образовать некоторое количество свободного 2',3'-сОМР. Действие данного позиционного изомера классического мессенджера 3',5'-сОМР на функциональную активность клеток практически не изучено.
Для понимания биологического действия экзогенных гуанилспецифичных РНКаз необходимо знать, как долго 2',3'-циклические нуклеотиды сохраняются в реакционной смеси с РНК в качестве субстрата, и как клетки отвечают на их действие. Учитывая известный противоопухолевый потенциал микробных РНКаз [10—14], мы задались целью подтвердить долговременное присутствие 2',3'-сОМР в реакции гидролиза РНК бина-зой и оценить эффект этого циклического нук-леотида по отношению к чувствительным к данному ферменту [15] клеткам аденокарциномы легких.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Прежде всего, мы установили, что метод с использованием антител позволяет обнаружить образование из РНК 2',3'-сОМР, причем его количество возрастает с увеличением концентрации РНК (рис. 1а). Выявлено, что 2',3'-сОМР в реакционной смеси образуется уже в первые минуты инкубации, его количество практически не меняется в течение 1 ч (рис. 1б). Максимальное количество 2',3'-сОМР определяется при рН 8.5, оптимальном для реакции гидролиза РНК биназой (рис. 1в). Из рис. 1а видно, что в реакционной смеси, содержащей 100 мкг/мл РНК, под действием биназы образуется 2',3'-сОМР в концентрации около 1 нМ; при содержании РНК 1000 мкг/мл концентрация 2',3'-сОМР возрастает в 5 раз.
Ранее нами показано, что биназа интернализу-ется клетками А549 [15], следовательно, ее каталитическая активность будет проявляться внутри клеток по отношению к доступному субстрату — РНК. Поскольку внутриклеточные ФДЭ способны разрушать образующийся продукт первого этапа каталитической реакции биназы, 2',3'-сОМР, мы проверили, насколько велико может оказаться снижение содержания последнего за счет активности ФДЭ.
а
ФДЭ идентифицированы практически во всех тканях — в клетках мозга, миоцитах сердца, эндо-телиальных клетках и др. Мы использовали мембранную и цитозольную фракции мозга крыс в качестве известного источника активных ФДЭ [16]. Выявлено, что в мембранной фракции мозга крыс ФДЭ более активны по сравнению с цито-зольной фракцией (рис. 2а), при этом уровень расщепления 2',3'-еОМР коррелирует с содержанием во фракциях 2',3'-циклонуклеотид-3'-фос-фодиэстеразы (еМР-азы) — фермента, который обнаруживается преимущественно в мозге взрослых крыс (рис. 2б). Отметим, что за 30 мин инкубации полного разрушения 2'3'-еОМР не происходит (рис. 3а), что подтверждает возможность присутствия в клетках, обработанных биназой, наномолярных концентраций данного продукта первого этапа каталитической реакции, характерной для циклизующих РНКаз семейства Т1.
Роль классических вторичных мессенджеров, 3',5'-еАМР и 3',5'-еОМР, особенно последнего, изучена далеко не полностью; активность их позиционных изомеров, 2',3'-гуанозинциклофос-фатов, в регуляции клеточных процессов подтверждена крайне немногочисленными фактами. Так, известно, что 3',5'-еОМР участвует в индукции апоптоза клеток рака груди MCF-7 и МЭЛ-МВ-468 [17], рака простаты РС3, поджелудочной железы РЛМС-1, желудка МКЫ45 [18], блокировании агрессивного течения глиомы [19]. Повышение за счет блокирования активности ФДЭ уровня внутриклеточного 3',5'-еОМР вызывает токсический эффект, аналогичное действие оказывают его аналоги с повышенной способностью к проникновению внутрь клетки [20]. Отметим, что проникновение в клетку циклических нуклеотидов и их аналогов не коррелирует с их липофильностью и происходит путем облегченного транспорта; в частности, для еЛМР скорость проникновения в клетки печени составляет 0.464 мкМ/мин х мл клеточного объема [21].
2',3'-еОМР способен усиливать включение ти-мидина в ДНК лимфоцитов [22], что, вероятно, связано с индукцией репаративного синтеза ДНК в ответ на токсическое действие этого нуклеоти-да. Для 2',3'-циклических нуклеотидов установлено их участие в регуляции проницаемости митохондрий клеток мозга [23]. Повышение внеклеточного уровня 2',3'-еАМР активирует образование пор в мембранах митохондрий клеток гладкой мускулатуры и гломерулярных клетках почки, индуцируя некроз и апоптоз [24]. При действии биназы на клетки лейкоза Касуми-1 нами также зафиксировано открытие митохондриальных пор и индукция апоптоза [25]. Учитывая вероятность образования 2',3'-еОМР внутри опухолевых клеток, обработанных биназой, мы мо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.