научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ-ПАРТНЕРОВ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ПЕПТИДА ГУМАНИНА С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕВОЙ ДВУГИБРИДНОЙ СИСТЕМЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ-ПАРТНЕРОВ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ПЕПТИДА ГУМАНИНА С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕВОЙ ДВУГИБРИДНОЙ СИСТЕМЫ»

ГЕНЕТИКА, 2006, том 42, № 2, с. 274-277

КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ

УДК 577.217

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ-ПАРТНЕРОВ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ПЕПТИДА ГУМАНИНА С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕВОЙ ДВУГИБРИДНОЙ СИСТЕМЫ

© 2006 г. В. В. Максимов, И. П. Арман, В. 3. Тарантул

Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182; факс: (495) 196-02-21; e-mail: tarantul@img.ras.ru Поступила в редакцию 24.03.2005 г.

С целью изучения молекулярных механизмов функционирования нейропротекторного пептида гу-манина, обладающего широким спектром действий, с помощью дрожжевой двугибридной системы осуществили поиск белков, которые способны взаимодействовать с ним. В результате скрининга кДНК библиотеки клеток эмбрионального мозга человека были обнаружены семь белковых партнеров гуманина, обладающих весьма различными функциями.

Сравнительно недавно был открыт новый ней-ропротекторный пептид гуманин (HN), состоящий из 24 аминокислот, который препятствует гибели нейронов, вызванной факторами, ответственными за болезнь Альцгеймера [1]. Дальнейшие исследования показали, что помимо нейропротек-ции HN обладает широким спектром разнообразных биологических активностей: способствует выживанию клеточных культур в условиях недостатка сыворотки [2], блокирует Бах-опосредованный апоптоз [3], восстанавливает у мышей обучаемость и кратковременную память [4], увеличивает уровень АТФ в неапоптотических клетках [5], а также, по-видимому, вовлечен в онкогенез [б]. Согласно имеющимся данным, ген, кодирующий HN, локализован в митохондриальной ДНК внутри хорошо известного гена 16S РНК [3, 5, 7].

В процессе изучения молекулярных механизмов биологического действия HN на клетки было показано его физическое взаимодействие с рядом белков, например такими, как Бах [3], TRIM 11 [8], связывающий инсулин-подобный фактор роста белок 3 [9], альфа-актинин 4 [10]. Однако пока нет оснований полагать, что какой-нибудь из этих белков играет роль рецептора, ответственного за нейропротекторную и иные функции пептида HN. По этой причине большой интерес представляет дальнейший поиск белка - потенциального рецептора HN, а также других белков, способных с ним взаимодействовать. С этой целью нами был предпринят скрининг библиотеки кДНК клеток эмбрионального мозга человека (Clontech) с помощью двугибридной дрожжевой системы (ДДС) [11, 12].

ДДС является эффективным методом поиска и обнаружения белок-белковых взаимодействий in vivo. В основе метода лежит представление о том, что начало транскрипции большинства генов осуществляется белковым комплексом с уча-

стием двух доменов: ДНК-связывающего (ДСД) и активирующего транскрипцию (АТД). При наличии физического взаимодействия между двумя белками, один из которых содержит ДСД (bait, "приманка"), а другой АТД (prey, "добыча"), образующийся димер способен активировать соответствующий репортерный ген.

Нами был использован вариант ДДС с двойной "приманкой" (основной и альтернативной) [12]. По сравнению с другими этот усложненный вариант существенно снижает число возможных артефактов и повышает эффективность скрининга. В качестве основной приманки использовали слитый белок, состоящий из ДСД LexA и HN, альтернативной приманкой выступал слитый белок ДСД cl - мутантный HN. "Добычей" служили белки, кодируемые кДНК клеток эмбрионального мозга человека, слитые с АТД. В качестве репор-терных генов использовали гены LEU2, LYS2, LacZ.

Открытые рамки считывания (ОРС), кодирующие пептид HN (основная "приманка") и пептид HNA с мутацией C8A (альтернативная "приманка"), который не обладает нейропротекторным действием [13], были собраны из нескольких химически синтезированных олигонуклеотидов. ОРС HN была сконструирована из синтетических олигонуклеотидов: HM-1 5'-atggctccacgagggttcagctg-3', HM-2 5'-gagacagctgaaccctcgtggagccat-3', MN-1 5'-tctct-tacttttaaccagtgaaattg-3', MN-2 5'-aggtcaatttcactggt-taaaagtaa-3', NN-1 5'-acctgcccgtgaagaggcgggcataa-3' и NN-2 5'-ttatgcccgcctcttcacgggc-3'. 5'-концы олигонуклеотидов HM-2, MN-1, MN-2 и NN-1 были фо-сфорилированы, после чего был проведен отжиг следующих пар олигонуклеотидов: HM-1 и HM-2, MN-1 и MN-2, NN-1 и NN-2; в результате соответственно получены дуплексы с липкими концами: HM, MN и NN. Посредством лигирования дуплексов HM, MN и NN по липким концам была собра-

на ОРС HN. Аналогично была собрана ОРС, кодирующая мутантный пептид HN с заменой C8A (HNA), где вместо олигонуклеотидов HM-1 и HM-2 использовались олигонуклеотиды HMYS-1 5'-atg-gctccacgagggttcagcgc-3' и HMYS-2 5'-gagagcgctgaac-cctcgtggagccat-3'.

Плазмиды, кодирующие экспрессирующиеся в дрожжах основную и альтернативную "приманки", конструировали на основе плазмид pMwi03 (содержит ДСД LexA) и pGBS10B (содержит ДСД cl), которые были любезно предоставлены И. Серебрийским. Для конструирования плазмиды pMWl03-HN, кодирующей основную "приманку", слитую с LexA ОРС, HN вставляли в плазмиду pMWl03 по сайту BamHI. Липкие концы, получившиеся в результате расщепления рестрикта-зой BamHI, достраивали фрагментом Клёнова. Плазмиду, содержащую ОРС HN в нужном направлении, отбирали посредством ПЦР с использованием праймеров HM-1 и 103-2 5'-agaaattcgcccg-gaattag-3'. Точность конструирования плазмиды pMW103-HN была подтверждена секвенированием области вставки с двух сторон с использованием праймеров 103-1 5'-tcgtagatcttcgtcagcagag-3' и 103-2.

Плазмида pGBS10B-HNA с альтернативной "приманкой", кодирующая слитый белок cI-HNA, была получена в результате вставки ОРС "му-тантного" пептида HNA по сайту PvulI в плазмиду pGBS10B. Плазмиду, содержащую ОРС HNA в нужном направлении, отбирали с помощью ПЦР с использованием праймеров HM-1 и 10-2 5'-agaaattcgcccggaattag-3'. Точность конструирования плазмиды pGBS10B-HNA была подтверждена секвенированием области вставки с двух сторон с использованием праймеров 10-1 5'-gagacgtttgg-gaatttgga-3' и 10-2.

Скрининг с помощью ДДС библиотеки кДНК клеток мозга эмбриона человека, сконструированной на базе вектора pJG4-5, проводили двумя способами: 1) клетки дрожжей штамма SKY191, котрансформированные плазмидами pMW103-HN, pGBS10B-HNA и репортерной плазмидой pDR8, содержащей ген LacZ, скрещивали с клетками дрожжей штамма SKY473, трансформированными плазмидами библиотеки кДНК эмбрионального мозга человека; 2) клетки дрожжей штамма SKY191, содержащие плазмиды pMW103-HN, pGBS10B-HNA и pDR8, котрансформировали плазмидами с библиотеки кДНК, как описано в [11].

Дрожжевые колонии, выросшие в течение семи дней на синтетической среде с галактозой и раффинозой без гистидина, урацила, триптофана, лейцина и дополненной антибиотиком G418 до концентрации 350 мкг/мл, проверяли на способность расти на синтетической среде с глюкозой без лейцина (на среде с глюкозой "добыча" не экспрессируется и рост указывает на "ложный" позитив) и на синтетической среде с галактозой и

раффинозой без лизина (рост указывает на взаимодействие "добычи" не с основной, а с альтернативной "приманкой"), а также на активацию репортёра LacZ на среде с галактозой и раффинозой с X-gal, как описано в [12]. Для дальнейшего исследования отбирали колонии, не выросшие на средах с глюкозой без лейцина и с галактозой и раффинозой без лизина, а также показавшие активацию репортёра LacZ на среде с галактозой и раффинозой. Во всех случаях отсутствовало взаимодействие гибридного белка библиотеки ("добычи") с ложной (альтернативной) "приманкой", кодирующей HNA.

Отобранные в процессе двухэтапного скрининга дрожжевые колонии разрушали стеклянными шариками и дрожжевой лизат использовали как для амплификации последовательностей библиотеки кДНК праймерами FP-1 5'-ctgagtg-gagatgcctcc-3' и FP-2 5'-ctggcaaggtagacaagccg-3', так и для электропорации компетентных клеток Escherichia coli. кДНК из отобранных дрожжевых клонов амплифицировали с помощью ПЦР и частично (400-600 пн) секвенировали. Нуклеотид-ные последовательности кДНК сравнивали с последовательностями базы данных NCBI (программа BLAST).

На следующем этапе клетки штамма SKY473 трансформировали либо очищенными препаратами плазмид, содержащими библиотеки кДНК, либо смесью линеаризованного EcoRI и XhoI вектора pJG4-5 и амплифицированной библиотеки кДНК, как описано в [12]. Фенотип взаимодействия воспроизводили скрещиванием клеток штамма SKY191, содержащих плазмиды pMW103-HN и pDR8, с клетками штамма SKY473, содержащими "добычу". После этого проверяли возможность активации генов-репортеров LEU2 и LacZ, а также зависимость этой активации от экспрессии белка - добычи. Специфичность взаимодействия подтверждали скрещиванием трансформантов штамма SKY191, содержащих альтернативную плазмиду pGBS10B-HNA, с клетками штамма SKY473, несущими плазмиды библиотеки, с последующей проверкой возможности активации гена-репортера LYS2.

В результате скрининга и многоступенчатого анализа 2.5 х 104 независимых колоний дрожжей, полученных скрещиванием и прямой трансформацией, было отобрано 26 клонов. Последовательности кДНК, выделенных из этих клонов, были разделены на девять групп (по размеру вставок кДНК) и по одной-две последовательности из каждой группы частично секвенированы. В итоге было обнаружено семь различных кДНК, соответствующих генам, продукты которых взаимодействуют с HN. Полученные данные суммированы в таблице.

276 МАКСИМОВ и др.

Белки, физически взаимодействующие с пептидом HN в дрожжевой двугибридной системе

Клоны с подтвержденным фенотипом и специфичностью взаимодействия с HN Соответствующие белки* Регистрационный номер

HNIP-8 Субъединица протеасомы а5 (а5СП) NM_002790

HNIP-11 Белок теплового шока 1 а с молекулярной массой 90 кДа (БТШ90-1а) NM_005348

HNIP-12 Неорганическая пирофосфатаза (НПФ) NM_021129

HNIP-13 Пероксиредоксин 1 (ПРДКС1) NM_002574

HNIP-14 Фосфобелок М фазы 8 (ФБМ8) NM_017520

HNIP-16 а1-субъединица эукариотического фактора элонгации трансляции 1 (ЭФЭТ1а1) NM_001402

HNIP-18 Митохондриальный фактор элонгации трансляции Ts (МФЭТ) NM_005726

* Установлены по нуклеотидной последовательности отобранных кДНК. Идентичность нуклеотидных последовательностей кДНК и соответствующих генов во всех случаях была выше 99%.

Таким образо

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком