научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ У ЗДОРОВЫХ ЛИЦ В “СУХОЙ” ИММЕРСИИ ПОСРЕДСТВОМ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ МОЧИ Биология

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ У ЗДОРОВЫХ ЛИЦ В “СУХОЙ” ИММЕРСИИ ПОСРЕДСТВОМ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ МОЧИ»

ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2014, том 40, № 3, с. 109-119

УДК 612.821

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ У ЗДОРОВЫХ ЛИЦ В "СУХОЙ" ИММЕРСИИ ПОСРЕДСТВОМ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ МОЧИ

© 2014 г. Л. Х. Пастушкова1'6, И. В. Доброхотов1,6, О. М. Веселова1'6, Е. С. Тийс2, А. С. Кононихин3' 4, А. М. Новоселова5'6, М. Купе5'6, М. А. Кусто5'6, И. М. Ларина1'6

1ФГБУНГНЦ РФ — Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 2Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск 3Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 4Институт энергетических проблем химической физики РАН, Москва 5CNRS UMR 6214, INSERM U1083, Angers University, Angers, France 6Associated French-Russian Laboratory CaDyWEC, Angers, France; Moscow, Russia E-mail: lpastushkova@mail.ru Поступила в редакцию 17.07.2013 г.

Проанализированы данные 5-суточной "сухой" иммерсии с использованием протеомных методов анализа белкового состава мочи и биоинформационных подходов. В моче здоровых добровольцев выявлено девять белков осуществляющих функции в сердечно-сосудистой системе. Показано, что "сухая" 5-суточная иммерсия вызывает в протеомном профиле мочи изменения, свидетельствующие о влиянии условий эксперимента на почечном, эндокринном, циркуляторном и метаболическом уровнях. Большинство этих изменений характеризуются очень быстрым как развитием, так и восстановлением при возвращении к нормальным условиям жизнедеятельности человека.

Ключевые слова: гломерулярный барьер, "сухая" иммерсия, сердечно-сосудистая система, хромато-масс-спектрометрический анализ, белковый профиль мочи.

Б01: 10.7868/80131164614030126

"Сухая" иммерсия (СИ), модель, широко используемая в гравитационной физиологии для моделирования эффектов воздействия невесомости на определенные системы организма, аккуратно воспроизводит сердечно-сосудистые, двигательные и другие изменения, с глубиной и скоростью развития, близкими к наблюдаемым в космических полетах [1—6]. В условиях "сухой" иммерсии снижается и перераспределяется реакция опоры, уравновешивающая действие сил гравитации. Это, в свою очередь, вызывает уменьшение деформации клеток, органов и тканей, устранение гидростатического компонента крови, снижение нагрузки на костно-мышечную систему, что проявляется в изменении позы и тонуса мышц, уровня двигательной активности. Перераспределение жидких сред организма и изменение афферентных потоков обусловливают изменение функционального состояния сердечнососудистой системы [7]. Согласно данным многочисленных исследований показано, что в "сухой" иммерсии происходит уменьшение общей воды тела. Обжатие мышц нижних конечностей иммерсионной средой, с уменьшением емкост-

ных сосудов, обеспечивает повышенный венозный возврат крови к сердцу, запускающий рефлекс Генри—Гауэра, что, в свою очередь, вызывает угнетение секреции антидиуретического гормона и альдостерона. Это приводит к уменьшению реабсорбции воды и электролитов (Na+) в почке. Развивается диурез по типу салуреза, на фоне ускоренного тока жидкости по канальцам нефрона. Функции сердечно-сосудистой системы в иммерсии также модифицируются. Как показали Bart V. с соавторами, исследовавшие состояние сердечно-сосудистой системы, бароре-флекторной регуляции сердечного ритма у здоровых молодых людей в условиях воздействия 1-часовой водной иммерсии, уже в первые минуты после начала иммерсионного воздействия снижается частота пульса и растет ударный объем. Авторы отметили, что в течение первых 20 минут условия иммерсии приводят к прогрессивному снижению среднего АД и общего сосудистого сопротивления [8].

Кудрин К.А. [9] исследовал изменения центральной гемодинамики человека в условиях воздействия 24-часовой "сухой" иммерсии. По мне-

нию автора, наблюдавшееся увеличение сердечного выброса в первые часы иммерсии связано с перераспределением крови в верхнюю половину тела, а его снижение через 1 сут — с уменьшением центрального объема крови за счет включения "разгрузочных" рефлексов Парина и Генри-Гауэ-ра. При исследовании более длительного — 7-су-точного — воздействия "сухой" иммерсии Васильевой Т.Д. с соавторами отмечены умеренные и обратимые изменения регионарной и центральной гемодинамики [10]. А.К. Ешманова, с помощью прибора "Пневмокард", показала, что в 7-су-точной иммерсии наблюдается постепенный рост показателя "миокард", отражающий суммарный эффект дисперсии микроколебаний ЭКГ, связанных с энерго-метаболическими сдвигами в миокарде [11]. Это послужило основанием для гипотезы о важной роли изменений водно-электролитного баланса в первые дни иммерсионного воздействия, которые могут быть одной из причин обменных сдвигов в миокарде, связанных с трансмембранным переносом ионов в кардио-миоцитах [12].

Регуляторные и метаболические изменения, происходящие в "сухой" иммерсии, отражаются в белковом составе жидкостей тела. В крови эти изменения ранее фрагментарно исследовались. Так, было показано увеличение содержания а1-анти-трипсина, а1-кислого гликопротеина, церуло-плазмина, гаптоглобина, а2-макроглобулина в электрофоретических фракциях а1- и а2-глобу-линов и уменьшение уровня аполипопротеина А в крови участников 7-суточной "сухой" иммерсии. Совокупность выявленных изменений трактовалась как развитие реакции "острой фазы" [13]. Результаты, полученные методом двумерного электрофореза обедненной фракции плазмы в 7-суточной "сухой" иммерсии, выявили достоверное увеличение уровня в крови аполипопроте-инов А-I, A-IV, а также E после СИ. В то же время, происходило снижение концентрации а-, р-фиб-риногена, фактора С4В комплемента и сывороточного амилоида Р [14]. Изучение параметров гемостаза в том же эксперименте показало значимое увеличение активности антиплазмина на 3-й день эксперимента, а после СИ — уменьшение ан-тикоагулянтого звена гемостаза — снижение активностей антитромбина III, плазминогена и протеина С [15]. Также, после 7-суточной СИ выявлялось достоверное снижение активности креат-инфосфокиназы, изоцитратдегидрогеназы, лактат-дегидрогеназы и тенденция к повышению активности глутаматдегидрогеназы и щелочной фосфатазы крови. При этом концентрации общего белка и альбумина оставались неизменными [16]. Использование мер профилактики — миостимуляции и механической стимуляции — частично компенсировало негативные эффекты 7-суточной "сухой" иммерсии в отношении содержания аполипопро-

теина С III, антитрипсина и сывороточного амилоида А1 [17].

Методы протеомики на основе масспектро-метрии при исследовании изменений белковой композиции крови в иммерсии дали новые результаты. Оказалось, что в СИ низкомолекулярная часть протеома сыворотки крови претерпевает значительные изменения. На 2-е и 3-и сутки эксперимента было обнаружено повышение пиков фрагментов ряда белков — С3 и С4 системы комплемента, высокомолекулярного кининогена и фибриногена. После СИ было отмечено достоверное увеличение площадей пиков аполипопро-теина CI (редуцированная форма с отщепленным треонином и пролином) и фрагментов С4 системы комплемента и фибриногена, что, возможно, связано с изменением двигательной активности испытателей [18].

Определенная часть белков крови может выявляться в моче. Отметим, что изучение белкового состава мочи здорового человека, методами про-теомики имеет значительные преимущества перед исследованиями крови, поскольку методически проще. Для оценки функционального состояния компонентов сердечно-сосудистой системы (ССС) такие исследования ранее не предпринимались.

Цель данной работы — получение дополнительной информации об адаптационных механизмах сохранения гомеостаза, с помощью протеомных технологий и поиск маркеров для оценки функционального состояния сердечно-сосудистой системы здоровых добровольцев, подвергшихся воздействию условий "сухой" иммерсии.

МЕТОДИКА

Исследования были проведены на стенде "сухая иммерсия" в ГНЦ РФ - ИМБП РАН, с участием 14 здоровых добровольцев-мужчин в возрасте от 21 до 29 лет, обследованных в ходе эксперимента с 5-суточной "сухой" иммерсией. Все добровольцы были допущены врачебно-эксперт-ной комиссией к проведению испытаний. Предварительно процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследовании, получено письменное Информированное согласие. Для имитации физиологических эффектов микрогравитации испытуемые погружались в воду (t = 33-34°C), в положении лежа до уровня верхней трети плеча, но не соприкасались с ней, будучи отделенными от воды водонепроницаемой свободно закрепленной к бортам тканью. В этом комплексном эксперименте нами были обследованы добровольцы, не подвергавшиеся в ходе СИ никаким дополнительным воздействиям,

направленным на предупреждение развивающихся адаптивных сдвигов в физиологических системах.

Образцы мочи были получены за 8 сут и за 2 сут до начала эксперимента (фон), на 2, 4 и 5-е сутки (утренняя фракция мочи после подъема, после ортопробы) "сухой" иммерсии и на 3-и, 8-е сутки после окончания воздействия. Образцами служили аликвоты второй фракции утренней мочи, срединной ее части. После получения образца, его центрифугировали с целью удаления загрязнений и концентрировали в ультрацентрифужных пробирках Amicon Ultra Ultracel 3 k. Образцы собранного биоматериала центрифугировали (2000 g в течение 10 минут при 0—4°C) и отбирали суперна-тант, пробоподготовка образцов к масс-спектро-метрии осуществлялась, как это описано ранее [19]. Хромато-масс-спектрометрический анализ минорных белков проводился на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США) и масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Германия). Для градиентной хроматографии использовали колонку с обращенной фазой ReproSil-Pur C18 (диаметр частиц 3 мкм, диаметр пор 100 A, Dr.MaischGmbH, Аммербух-Энтринген, Германия), изготовленную с использованием капилляра-эммитера (Pico-tip, NewOb-jectivelnc., США) способом, описанным Ишиха-ма и др. [20].

Измерение масс-спектров продуктов хроматографии производилось в диапазоне 300—1600 Thm/z. Каждый образец мочи был проанализирован трижды и для последующего

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком