научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ФОРМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, АССОЦИИРОВАННЫХ С МИТОХОНДРИЯМИ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ФОРМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, АССОЦИИРОВАННЫХ С МИТОХОНДРИЯМИ»

УДК 577.23

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ФОРМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, АССОЦИИРОВАННЫХ

С МИТОХОНДРИЯМИ

© 2013 г. О. В. Крестинина1, |П. Р. Макаров)1, Ю. Л. Бабурина1, А. Е. Гордеева1, 2,

Т. С. Азарашвили1, *

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2 Пущинский государственный естественно-научный институт Министерства образования и науки

Российской Федерации, Пущино

В настоящее время накоплено значительное количество данных, показывающих, что во время ней-родегенеративных процессов происходит нарушение функций митохондрий. Одной из причин, приводящей к дисфункции митохондрий, является увеличение проницаемости внутренней мембраны, и как следствие этого, формирование, так называемой, неселективной поры (тРТР), рассматриваемой как ранняя стадия программируемой гибели клеток. Одним из факторов нейродегенерации считается нарушение взаимодействия между глиальными клетками и аксоном. Недавно нами показано, что один из белков миелина, фосфодиэстераза 2',3'-циклических нуклеотидов (СМРаза), локализуясь в митохондриях, участвует в регуляции тРТР. В настоящей работе было установлено, что два фосфобелка с молекулярными массами 21.5 и 17 кДа увеличивают статус фосфорилирования при открытии поры. Методом двумерного электрофореза с последующей масс-спектрометрией эти фосфобелки были идентифицированы как фосфорилированные изоформы основного белка миелина (МВР). Было обнаружено, что уровень ассоциации 21.5 и 17 кДа изоформ МВР с митохондриями увеличивается в условиях открытой поры. Таким образом, еще один миелиновый белок, возможно, вовлекается в регуляцию тРТР.

Ключевые слова: митохондрии мозга, неселективная пора, фосфорилирование, основной белок миелина.

БО1: 10.7868/81027813313040055

ВВЕДЕНИЕ

Изучение процессов нейродегенерации в настоящее время чрезвычайно актуально и важно с точки зрения выяснения основ патогенеза таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Паркин-сона, синдрома Дауна и рассеянного склероза. Одним из факторов нейродегенерации является нарушение взаимодействия между глиальными клетками, синтезирующими миелин, и аксоном. Миелин, представляя собою мультислойную мембрану, обволакивает аксон, защищает его от повреждений и способствует быстрому проведению нервного импульса. Среди компонентов миелино-вых мембран находят как липиды, так и белки. Из миелиновых белков отмечают основные три белка, содержание которых достигает почти 80% от всего белкового состава миелина. К этим белкам относятся протеолипид миелина (РЬР), основной миели-

*Адресат для корреспонденции: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3; тел. (4967) 73-91-46; е-таП: azartam@yandex.ru.

новый белок (МВР) и фосфодиэстераза, гидроли-зующая 2',3'-циклонуклетиды (СМРаза). Таким образом, миелиновая бислойная мембрана обеспечивает эффективную изоляцию аксона и высокое сопротивление для быстрого проведения нервного импульса по аксонам. По миелинизированным волокнам импульс проводится приблизительно в 5—10 раз быстрее, чем по немиелинизированным [1,2]. Функционирование миелиновых белков регулируется посредством пост-трансляционной модификации, в частности, СМРаза и МВР регулируются посредством обратимого фосфорили-рования/дефосфоилирования, а миелиновый протеолипид посредством ацилирования (паль-митоилирования). Один из миелиновых белков (СМРаза) был обнаружен и вне миелина. Вначале Драйлинг и коллеги обнаружили фосфодиэстераз-ную активность во внешней и внутренней мембранах митохондриях печени [3], но сам белок был идентифицирован в митохондриях недавно. Нами впервые СМРаза была идентифицирована в митохондриях, изолированных из мозга, печени, серд-

321

4*

ца и поджелудочной железы [4]. При исследовании функциональной роли CNPa3bi в митохондриях было установлено, что она сама способна модулировать проницаемость митохондриальных мембран и предотвращать открытие митохондриальной неселективной поры, а ее субстрат (2',3'-c-AMP) обладает свойствами инициировать открытие Са2+-ин-дуцируемой и CsA-чувствительной поры, которая рассматривается как начальная стадия программируемой гибели клеток. Пора формируется во внутренней мембране митохондрий при достижении в матриксе сверх-пороговых концентраций кальция или в ответ на окислительный стресс. При этом проницаемость внутренней мембраны увеличивается так, что позволяет прохождению сквозь нее соединениям с молекулярной массой до 1.5 кДа. Открытие тРТР сопровождается деполяризацией внутренней мембраны, набуханием митохондрий и выходом кальция и апоптогенных факторов, которые могут инициировать как каспаза-зависи-мый, так и каспаза-независимый путь апоптоза [5]. Несмотря на многолетние исследования структурный состав митохондриальной поры и механизм ее регуляции точно не установлены. К настоящему моменту установлена только роль циклофилина Д, фосфатного переносчика и белка транслокатора (TSPO, известного ранее как периферический бензодиазепиновый рецептор), и гидрофобной субъединицы с, входящей в состав Fo сектора АТР синтетазы в функционировании тРТР [6—9]. Что касается таких компонентов, как порин внешней мембраны (VDAC) и транслоказа адениновых нук-леотидов (ANT) внутренней мембраны, то эксперименты, выполненные на генетически модифицированных мышах, показали, что они не являются структурными элементами поры, оставаясь основными ее модуляторами [10, 11]. В механизмах регуляции функционирования неселективной поры также существует много неопределенностей, поэтому используют различные подходы для выяснения этого вопроса. Ранее нами было показано существование нового молекулярного механизма регуляции систем энергопродукции, основанного на процессе Са2+-зависимого фосфорилирования мембранно-связанных митохондриальных белков и был выявлен спектр белков (43, 17 и 21.5 кДа, а также 3.5 кДа) митохондрий мозга и печени, подвергающихся фосфорилированию. Было обнаружено, что а) ионы кальция способны влиять на статус фосфорилирования обнаруженных белков и б) изменение уровня фосфорилирования этих белков коррелирует с инициацией открытия неспецифической поры в митохондриях. В частности, в условиях открытой поры уровень фосфорилирования 43—46 и 17 и 21.5 кДа белков увеличивался, а уровень 3.5 кДа пептида, снижался. В результате проведения идентификации этих белков с использованием методов иммуннопреципитации и Вестерн блот анализа, а также масс-спектрометрии

46 кД белок был детектирован как фосфодиэсте-раза CNPaзa, а 3.5 кДа пептид как гидрофобная субъединица "с" (дициклогексилкарбодиимид (DCCD)-связывaющий протеолипид) мембранного сектора F0F1АТР синтетазы [7, 12]. Однако, фосфобелки с молекулярной массой 21.5 и 17 кДа оставались неидентифицированными, поэтому в настоящей работе были проведены исследования по идентификации этих фосфобелков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение митохондрий мозга. Митохондрии мозга крысы выделяли по методу Симса [13], модифицированному в нашей лаборатории. Изолированный мозг измельчали, очищали от кровеносных сосудов и гомогенизировали в десятикратном объеме среды, содержавшей 320 мМ сахарозу, 10 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 0.5 мМ К+-ЭДТА, 0.5 мМ ЭГТА, 0.2% БСА (все реактивы были из Sigma, США) с помощью стеклянного гомогенизатора. Гомогенат центрифугировали при 2000 g в течение 3 мин, осадок удаляли, а супернатант центрифугировали повторно для более полного удаления ядер и поврежденных клеток. Осадок митохондрий, полученный центрифугированием при 12500 g (10 мин) при 4°С, затем промывали, суспендируя в среде выделения, не содержащей ЭДТА, ЭГТА и БСА с последующим центрифугированием при 11500 g 10 мин. Полученный препарат суспендировали в той же среде. Все процедуры выполняли при температуре 4°С.

Фосфорилирование митохондрий мозга. Фос-форилирование белков митохондрий проводили по методу, разработанному ранее в нашей лаборатории [7]. В реакции использовали смесь "холодной" ATP и меченной [у-32Р]АТЕ Общая концентрация ATP в пробе составляла 0.5—1 мМ/л, проба содержала 5—7 мкКи ^^^ATP. При изучении процессов фосфорилирования белков в условиях открытой тРТР из ячейки со встроенными селективными электродами, позволяющими регистрировать изменение концентрации кальция и изменение мембранного потенциала, отбирали аликвоту митохондрий в контрольных условиях и условиях, когда открытие неселективной поры индуцировали последовательным добавлением небольших порций кальция до достижения пороговой концентрации, инициирующей ее открытие. Аликвоту митохондрий (20 мкл) смешивали с 5 мкл смеси меченой и "холодной" ATP для фос-форилирования белков. Для предотвращения гидролиза ATP к пробам добавляли ингибитор FOF1-ATP-aзы олигомицин (1.5 мкМ). Стандартное время фосфорилирования составляло 3 мин, реакцию останавливали, добавляя 20 мкл солю-билизирующего раствора, содержащего 0.35 М трис-HCl (pH 7.8), 10% глицерин, 15% додецил-

сульфат Na (SDS), 25% Р-меркаптоэтанол. Пробы выдерживали в кипящей бане в течение 3 мин.

Определение функций mРТР. Параметры функционирования неспецифической поры измеряли в термостатируемой ячейке, в которую вмонтированы селективные электроды: ТРР+, Са2+ и Clar-ck-type O2 (Нико, Россия) [14]. Среда измерения содержала 10 мМ Tris-HCl буфере рН 7.4, 120 мМ KCl, 0.4 мМ KH2PO4, 5 мМ сукцината калия и 2.5 мкМ ротенона. Сукцинат калия использовали в качестве субстрата для дыхания митохондрий. Концентрация белка в ячейке составляла 1 мг/мл. Открытие тРТР в митохондриях индуцировали пороговой концентрацией Са2+, которую определяли для каждого эксперимента и которая составляла 100 нмоль/мг белка.

Электрофорез и Вестерн блот. Электрофорез в денатурирующих условиях проводили в мини камере (Hoefer) по методу Лэммли [15]. На каждую дорожку геля наносили по 10 мкг белка. В качестве маркеров использовали наборы фирмы "Farmacia Biotech." (США), содержащие высокомолекулярные (14.4—97 кДа) и низкомолекулярные (3.46—16.9 кДа) маркерные белки. После проведения электрофореза гели фиксировали, окрашивали Кумасси R-250 и высушивали на воздухе между листами целлофана. Для получения авт

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком