МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 6, с. 859-860
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.8.088.5
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ СИНТЕЗА ЭКТОИНА У УМЕРЕННО ГАЛОФИЛЬНОЙ АЛЬФАПРОТЕОБАКТЕРИИ METHYLARCULA MARINA © 2010 г. А. С. Решетников, В. Н. Хмеленина, Ю. А. Троценко1
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Поступила в редакцию 05.07.2010 г.
Эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пири-мидинкарбоновая кислота) — широко распространенный осмопротектор у галофильных и галотолерантных прокариот, является также полифункциональным биопротектором. Биосинтез эктоина из аспартата осуществляется с участием специфических ферментов Ь-2,4-диамино-бутират(ДАБ)-аминотрансферазы (EctB), ДАБ-ацетилтрансферазы (EctA) и эктоинсинтазы (EctC). Гены, кодирующие эти ферменты, у большинства изученных продуцентов эктоина организованы в кластере ectABC или ectABC-ask, кодирующем также специфическую изоформу аспар-таткиназы (Ask) [1, 2].
Ранее эктоин и гены его биосинтеза были обнаружены нами у растущих на метане или метаноле га-лофильных метилотрофных гаммапротеобактерий родов Methylomicrobium и Methylophaga [2, 3]. Кроме эктоина, эти метилотрофы накапливают в качестве дополнительных осмолитов глутамат и сахарозу. Поиск и изучение новых метилотрофных продуцентов эктоина обусловлен практическими задачами получения этого биопротектора на основе одноуглерод-ных субстратов — метана, метанола и др.
Аэробная метилобактерия Methylarcula marina hall растет на метиламине в диапазоне солености 1— 10% NaCl и синтезирует эктоин в качестве осмопро-тектора (до 20% веса сухих клеток), но не накапливает сахарозу [4]. Неспособность M. marina синтезировать сахарозу имеет ряд преимуществ, поскольку предполагает более высокую эффективность конверсии одноуглеродного субстрата в целевой продукт и исключает ряд дополнительных стадий очистки эктоина. В отличие от ранее изученных ме-тилотрофов, M. marina является представителем A1-phaproteobacteria. Гены и ферменты, ответственные за биосинтез эктоина у представителей данного класса протеобактерий, ранее не исследовались, однако их характеристика важна для понимания механизмов осмоадаптации и эффективного использования продуцентов эктоина.
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm. pushchino.ru).
Цель данной работы — идентификация генов биосинтеза эктоина у M. marina.
M. marina культивировали при 29°С на cреде "К" с 0.3% (в/об) метиламина [5]. Эктоин экстрагировали из биомассы и анализировали как описано ранее [4]. Активность ДАБ-ацетилтрансферазы определяли в соответствии с опубликованными методиками [2, 3].
Для идентификации генов, кодирующих специфические ферменты синтеза эктоина у M. marina, использовали методологию, основанную на полимераз-ной цепной реакции (ПЦР). В качестве первого этапа проводили ПЦР с вырожденными праймерами Tra3 и CR [2]. На основании полученной последовательности синтезировали гомологичные праймеры halR (5'-CAATACCCATGCCTTCGTCACC-3') и halF (5'-CT-TGTGATCGAGACTTCGGGCAGC-3'), которые применяли в комбинации с вырожденными прайме-рами Hal-A (5'-TT(C/T)GTITGGCA(A/G)GT-NGC-3') и halV (5'-GCATAAGAAGTCCTTTCG-CACC-3') для двух дополнительных ПЦР (рисунок).
Для идентификации 5'-конца гена ectA и 3'-кон-ца гена ask были проведены две "векторетные" ПЦР [6] с использованием в качестве матрицы геномной ДНК, обработанной EcoRI, и специфических праймеров hal-B (5'-GCATAAGAAGTC-CTTTCGCACC-3') и Hal-ask (5'-TGTCGCCGAT-CAGCTTTCCAAC-3').
В результирующей последовательности фрагмента ДНК размером 5.26 т.п.н. были обнаружены пять открытых рамок считывания. Четыре из них, ориентированные в одном направлении, кодировали белки, проявляющие сходство с белками EctA, EctB, EctC и Ask Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (36, 52, 49 и 50% гомологии соответственно) [2]. Расстояние между предполагаемыми генами ectA и ectB, ectB и ectC, ectC и ask, соответственно, составляло 55, 7 и 2 п.н., что указывало на их возможную организацию в одном опероне ectABC-ask. Продукт пятого гена, расположенного в дивергентном направлении на расстоянии 175 п.н. от стартового кодона гена ectA, проявлял сходство (54% идентичности) с транскрипционным регулятором EctR Mm. alcaliphilum 20Z [3].
Проведенный нами анализ геномов, представленных в GenBank, выявил наличие генов синтеза
860
Eco Rl
Hal-A
РЕШЕТНИКОВ и др.
Tra3 CR
Hal-ask
Eco Rl
ect R I
ect A
C 20
ect B
^ ect C ^
ask
hal-B
halR halF
halV
C 20
Схема организации и стратегия секвенирования генов биосинтеза эктоина у Methylarcula marina. Нуклеотидная последовательность кластера ectABC-ask Methylarcula marina, определенная в настоящем исследовании, депонирована в Ген-Банк под номером GU249592.
эктоина у 200 видов бактерий и одного археона. Филогенетический анализ транслированных аминокислотных последовательностей этих генов показал наиболее высокое сходство Ect-белков у M. marina и других представителей альфапротеобактерий, тогда как сходство с гомологичными белками гаммапро-теобактерий, в том числе, метано- и метилотроф-ных, было более отдаленным. За несколькими исключениями, Ect-белки гамма- и альфапротеобак-терий формируют отдельные кластеры на филогенетическом дереве. Это может свидетельствовать о древнем приобретении генов синтеза эктоина и длительной эволюции в рамках соответствующего филума.
Клонированием гена ectA из M. marina, экспрессией в Escherichia coli и очисткой рекомбинантного белка никель-аффинной хроматографией по ранее описанной схеме [3, 7] получен гомогенный препарат ДАБ-ацетилтрансферазы с 6 гистидинами на С-конце. EctA является 40-кДа гомодимером, проявляет максимальную активность при pH 7.5—8.0 и 15°C, причем фермент стабилен только в присутствии NaCl (0.1 M). Следовательно, по некоторым свойствам ДАБ-ацетилтрансфераза из M. marina отличается от ферментов из Mm. alcaliphilum 20Z, Methylophaga alcalica и Methylophaga thalassica, имеющих максимальные активности при температурах, соответственно, 20, 35, 30°C и рН 9.5 9.0 и 8.2. Низкий температурный оптимум EctA следует учитывать, в частности, при подборе условий выращивания данного потенциального продуцента эктоина из промстоков, содержащих метиламин.
Итак, нами впервые установлено, что у альфа-протеобактерии M. marina гены биосинтеза эктоина организованы в кластере ectABC-ask, которому предшествует ген ectR потенциального транскрипционного регулятора, аналогично другим метилотрофам, синтезирующим эктоин с высокой эффективностью (рисунок). Полученные результаты расширяют знания об организации и регуляции биосинтеза эктоина у метилотрофных бактерий различных
филогенетических групп и открывают перспективы дальнейших исследований по эффективному использованию продуцентов этого полифункционального биопротектора.
Авторы благодарят Качаева З.М. и Мустахи-мова И.И. за помощь в работе.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ 09-04-92520-ИКа, ГК 02.740.11.0296, Ми-нобрнауки РФ РНП 2.1.1/605 и CRDF ЯБ1-2509-М0-03.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Galinski E.A. Osmoadaptation in bacteria // Adv. Microbial. Physiol. 1995. V. 37. P. 273-328.
2. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Characterization of the ectoine biosynthesis genes in obligate haloalkalotolerant methanotroph Methylomicrobi-um alcaliphilum 20Z // Arch. Microbiol. 2006. V. 184. P. 286-296.
3. Mustakhimov I.I., Rozova O.N., Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Murrell J.C., Trotsenko Y.A. Characterization of the recombinant diaminobutyric acid acetyltransferase from Methylophaga thalassica and Methylophaga alcalica // FEMS Microbiol. Lett. 2008. V 283. P. 91-96.
4. Доронина Н.В., Сахаровский В.Г., Драчук С.В., Тро-ценко Ю.А. Органические осмопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. № 4. С. 457-462.
5. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova T.P. Methylarcula marina gen. nov., sp. nov. and Methylarcula terricola sp. nov.: novel aerobic, moderately halophilic, facultatively methy-lotrophic bacteria from coastal saline environments // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 1849-1859.
6. Ko W.-Y., Ryan M.D., Akashi H. Molecular phylogeny of the Drosophila melanogaster species subgroup // J. Mol. Evol. 2003. V. 57. P. 562-573.
7. Решетников А.С., Мустахимов И.И., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А.. Клонирование, очистка и характеристика диаминобутиратацетилтрансферазы из галото-лерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z // Биохимия. 2005. Т. 70. № 8. C. 1063-1069.
МИКРОБИОЛОГИЯ том 79 № 6 2010
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.