МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 4, с. 559-565
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 577.21:579.23''315
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ДИСПЛЕЯ ЭКСПРЕССИИ ШЕСТИ ОТВЕЧАЮЩИХ НА ЗАСУХУ ТРАНСКРИПТОВ ДРЕВОВИДНОГО ХЛОПЧАТНИКА
Gossypium arboreum
© 2008 г. Asma Maqbool, Muzna Zahur, Muhammad Irfan, Muhammad Younas, Khan Barozai, Bushra Rashid, Tayyab Husnain*, Shickh Riazuddin
Center of Excellence in Molecular Biology, University of Punjab, Thokar Niaz Baig Lahore, 53700 Pakistan
Поступила в редакцию 16.06.2007 г. Принята к печати 09.07.2007 г.
Гены хлопчатника Gossipium arboreum, экспрессия которых изменяется под действием засухи, изучены недостаточно, хотя эта группа генов может оказаться ценной для улучшения существующих сортов хлопчатника. С помощью дифференциального дисплея, основанного на обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией, сравнили уровни экспрессии генов в растениях, подвергнутых водному стрессу, и в контрольных растениях. С использованием 93 комбинаций пар праймеров выявлено повышение уровня 30 транскриптов, для 10 из которых результаты оказались ложно-положительными. Оставшиеся 20 кДНК экстрагировали из геля, амплифицировали, клонировали и секвенировали. Показана существенная гомология шести транскриптов с известными генами. Методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией в реальном времени подтверждено значительное повышение экспрессии пяти из шести этих транскриптов в листьях, подвергнутых водному стрессу. Значимость наших результатов определяется немногочисленностью данных об изменении экспрессии гена универсального белка стресса и мобильных элементов при засухе и отсутствием таких данных для хлопчатника.
Ключевые слова: дифференциальный дисплей, засуха, хлопчатник, Gossypium, ретротранспозон, транспозон, универсальный белок стресса.
IDENTIFICATION AND EXPRESSION OF SIX DROUGHT RESPONSIVE TRANSCRIPTS THROUGH DIFFERENTIAL DISPLAY IN DESI COTTON (Gossypium arboreum), by Asma Maqbool, Muzna Zahur, Muhammad Irfan, Muhammad Younas, Khan Barozai, Bushra Rashid, Tayyab Husnain*, Shiekh Riazuddin (Center of Excellence in Molecular Biology, University of Punjab, 87-Canal Bank Road, Thokar Niaz Baig Lahore, 53700 Pakistan; *e-mail: tayyab@cemb.edu.pk). There is not enough information available on drought-modulated gene(s) in Gossypium arboreum, which can be a valuable gene pool for improving modern cotton cultivars. In the present work differential display reverse transcriptase PCR (DDRT) was used to compare overall differences in gene expression between water stressed and control plants. By screening 93 primerpair combinations DDRT technique resulted in up-regulation of 30 cDNA transcripts. Through reamplification and quality control assay 10 cDNA transcripts appeared false positive. The remaining 20-cDNA transcripts were extracted from the gel, reamplified, cloned and sequenced. Homology search revealed that 6 transcripts showed significant homology with known genes. Real-time RT-PCR showed that among 6 transcripts 5 showed significant over expression in water stressed leaves as compared to control. This is an important finding since there are only few reports of universal stress protein and transposable elements are available in plants but none in cotton under drought condition.
Key words: differential display, drought, Gossypium, retrotransposon, transposon, universal stress protein.
Абиотические стрессовые факторы - засуха, соленость почвы, экстремальные температуры, химические соединения и окислительный стресс - это неблагоприятные факторы окружающей среды, представляющие серьезную проблему для сельского
* Эл. почта: tayyab@cemb.edu.pk
хозяйства. Абиотический стресс приводит к снижению урожая сельскохозяйственных культур в среднем более чем на 50% [1, 2]. Выжить под действием стрессовых факторов растения могут, если сумеют адаптироваться к ним путем изменения физиологических, биохимических и связанных с развитием процессов. В частности, индуцируется синтез опре-
деленных белков [3]. Поскольку каждая функция у растений определяется далеко не одним геном, изучение дифференциально экспрессирующихся генов может привести к идентификации новых биомаркеров [4].
Защитный эффект при обезвоживании клеток у многих растений оказывают несколько белков стресса, а также растворимые сахара [5, 6]. Универсальный белок стресса (Usp) - это небольшой цито-плазматический белок, синтез которого возрастает в несколько раз при воздействии стрессовых факторов, угрожающих жизни клетки, что свидетельствует о его роли в повышении общей устойчивости к стрессу [7, 8]. Трегалоза представляет собой один из наиболее эффективных осморегуляторных сахаров [9, 10], она может выполнять функцию осмопротек-тора при стрессе, вызванном потерей влаги [11]. Важную роль в адаптации растения к изменяющимся условиям окружающей среды играют мобильные элементы, вносящие свой вклад в генетическую вариабельность и изменение экспрессии генов [12]. При засухе, тепловом стрессе и механическом отделении листьев наблюдается индукция генов некоторых членов семейства водорастворимых белков, связывающих хлорофилл a/b [13]. Такие гены идентифицируют методом дифференциального дисплея мРНК путем сравнения уровней их транскриптов при нескольких видах обработки растений [14].
Задача нашей работы состояла в поиске и выделении транскриптов древовидного хлопчатника, дифференциально экспрессирующихся при водном стрессе. Выявление таких транскриптов - первый шаг к обнаружению новых генов и изучению их ре-гуляторных элементов, что позволяет разработать новые стратегии и лучше понять механизмы адаптации растений к засушливым условиям.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Растительный материал и стрессовое воздействие. Семена древовидного хлопчатника (Gossypi-ит атЬотвыш) сорта №^171, известного своей засухоустойчивостью, получены на селекционной станции Raiwind. Растения выращивали в теплице CEMB на грунте, состоящем их торфа, песка и земли, взятых в соотношении 1 : 1 : 1, при температуре 25 ± 2°С и относительной влажности около 50%. В дополнение к естественному освещению использовали металлогалогеновые лампы (400 Вт). В верхней точке купола в полдень максимальная освещенность достигала 1500 мкмоль квантов/м-2с-1. Периодически рассчитывали объем чистой воды, добавляемой в сосуды с растениями, с тем, чтобы поддерживать гравиметрическую влажность на уровне 5% при стрессе или 15% в отсутствие стресса. 45-дневные сеянцы выдерживали в условиях засухи в течение 10 дней. Листья растений собирали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.
Дифференциальный дисплей на основе ОТ-ПЦР (ДДОТ-ПЦР). мРНК анализировали методом дифференциального дисплея согласно [14]. Суммарную РНК выделяли из 1 г листьев [15]. Обработанную ДНКазой суммарную РНК использовали для проведения обратной транскрипции с якорным прайме-ром олиго-dTll; реакцию проводили с набором Re-vertAid H minus для синтеза первой цепи кДНК ("Fermentas", Литва) согласно протоколу изготовителя. ПЦР проводили в термоциклере PTC-100 ("MJ Research").
Всего использовали 11 якорных и 15 случайных праймеров (табл. 1). Реакционная смесь для ДДОТ-ПЦР (20 мкл) содержала 1 ед. акт. Taq-полимеразы, по 1 мкМ случайного и якорного праймеров, 0.05 мкМ dNTP, однократный буфер для ПЦР, 3 мкл кДНК и 2.5 мМ MgCl2. Режим амплификации: начальная денатурация при 94°С, 4 мин; 40 циклов (денатурация при 94°С, 30 с; отжиг при 40°С, 2 мин; синтез при 72°С, 30 с) и заключительный синтез при 72°С в течение 5 мин. К реакционным смесям добавляли равные объемы буфера для нанесения образцов (95% формамида, 0.1% ксиленцианола FF, 0.1% бромфенолового синего) при 90°С в течение 2 мин. Продукты денатурации разделяли электрофорезом в 6%-ном полиакриламидном геле при постоянной мощности тока 70 Вт. Гели окрашивали серебром согласно руководству компании "Bio-Rad", но для фиксации геля сразу же после электрофореза использовали 7.5%-ную уксусную кислоту (по объему). Реакцию окрашивания останавливали, добавляя 7.5%-ную уксусную кислоту и фотографировали гель с помощью системы документирования результатов с программным обеспечением GrablT 2.5.
Выделение, амплификация и верификация дифференциально экспрессируемых транскриптов. Полосы, постоянно присутствующие на электрофоре-граммах обработанных образцов, вырезали из геля. Фрагменты ДНК экстрагировали из геля [16, 17]. ДНК осаждали этанолом, растворяли в стерильной дистиллированной воде и реамплифицировали в 25 мкл смеси для ПЦР с теми же праймерами, с которыми получили этот продукт методом ДДОТ-ПЦР.
Во всех случаях проводили контрольную реакцию без обратной транскриптазы для выявления потенциального загрязнения препарата РНК геномной ДНК, которая могла амплифицироваться в последующей ПЦР. Реамплифицированные продукты ПЦР разделяли в агарозном геле. Полосы вырезали, соответствующие фрагменты элюировали из геля с помощью набора для экстракции ДНК ("Fermentas", Литва) и клонировали с помощью набора для клонирования TE ("Invitrogen") согласно протоколу изготовителя с небольшими модификациями.
Секвенирование ДНК и анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием набора ABI Prism Dye Terminator kit на автоматическом секвенаторе ABI 3100. Секвенировали обе цепи с
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ДИСПЛЕЯ 561 Таблица 1. Праймеры, использованные в дифференциальном дисплее на основе ПЦР
Случайный 5'-праймер Нуклеотидная последовательность Якорные 3'-праймеры с oлиго-dT Нуклеотидная последовательность
P1 5 -ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGGA-3' Т1 5'-CATTATGCTGAGT-GATATCTTTTTTTTTAA-3'
P2 5 -ATTAACCCTCACTAAATCGGTCATAG-3' T2 5'-CATTATGCTGAGT-GATATCTTTTTTTTTAC-3'
P3 5 -ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTGG-3' T3 5'-CATTATGCTGAGT-GATATCTTTTTTTTTAG-3'
P4 5 -ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTAG-3' T4 5'-CATTATGCTGAGT-GATATCTTTTTTTTTCA-3'
P5 5 -ATTAACCCTCACTAAAGATCTGACTG-3' T5 5'-CATTATGCTGAGT-GATATCTTTTTTTTTCC-3'
P6 5' -ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGTG-3' T6 5'-CATTATGCTGAGT-GATATCTTTTTTTTTCG-3'
P7 5' -ATTAACCCTCACTAAATGCTGTATG-3' T7 5'
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.