БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2007, том 33, № 6, с. 653-656
= ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 577.112.5:577.115
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ НОВОГО БЕЛКА ГАПОНИНА
ИЗ КЛЕТОК ЛИНИИ HL-60
© 2007 г. А. В. Вонаршенко*, В. В. Радченко*#, М. В. Гапон*, И. Л. Родионов**, И. И. Бабиченко***, Д. Л. Какуев*, И. Д. Артамонов*, А. В. Гарковенко*, Л. Г. Дьячкова*,
В. М. Липкин*, И. А. Костанян*
*Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10;
**Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
г. Пущино Московской обл.;
***Российский университет дружбы народов, Москва
Поступило в редакцию 19.04.2007 г. Принято к печати 05.06.2007 г.
В клетках линии промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 обнаружен новый белок гапонин (haponin - HLDF-alike protein), иммунореактивный с поликлональными антителами к фактору диф-ференцировки клеток HL-60 - HLDFß. Определение частичной структуры белка позволило выявить иммуногенный пептид, на основании аминокислотной последовательности которого были синтезированы вырожденные праймеры, позволившие клонировать полноразмерную кДНК гапо-нина. Получена устойчивая гетерологическая экспрессия этой кДНК в клетках E. coli штамма RosettaTM. Препараты природного и рекомбинантного белка давали перекрестную иммунохимическую реакцию с полученными на иммуногенный пептид антителами.
Ключевые слова: гапонин (haponin - HLDF-alike protein), клетки линии HL-60, HLDF, эукариотиче-ский фактор инициации трансляции eIF1a, фактор транскрипции STAT1.
Ранее из клеток линии промиелоцитарного лейкоза человека HL-60, индуцированных ретиноевой кислотой, был выделен и охарактеризован эндогенный фактор дифференцировки HLDF [1]. В составе белка было обнаружено два биологически активных фрагмента: RRWHRLKE, обладающий ДНК-гидролизующей активностью, и TGENHR, полностью воспроизводящий дифференцирующую активность полноразмерного HLDF на клетках HL-60 [2, 3]. Нуклеотидная последовательность кДНК HLDF имеет значительную гомологию со структурой кДНК рибосомного белка S21 (RPS21), а мРНК HLDF возникает в результате аб-нормального сплайсинга и редактирования мРНК гена RPS21 [2].
В процессе поиска гена фактора HLDF в геноме клеток HL-60 был обнаружен псевдоген, нуклеотидная последовательность которого кодирует бе-
Сокращения: БЬВЕ и ^БЕР - факторы дифференцировки клеток ^-60; еШ1а - эукариотический фактор инициации трансляции 1а; БТЛТ1 - сигнальный переносчик и активатор транскрипции 1; ПЦР - полимеразная цепная реакция. # Автор для связи (тел.: (495) 336-5111; факс: (495) 336-6166; эл. почта: radchenko@mai1.ibch.ru).
лок, высокогомологичный HLDF. В отличие от HLDF, у этого белка, названного HLDFß, отсутствует ДНК-гидролизующий фрагмент, последовательность которого заменена на последовательность RPMASLQK, но сохраняется второй, дифференцирующий фрагмент. Белок был синтезирован твердофазным методом [4]. Оказалось, что HLDFß, как и фактор дифференцировки HLDF, обладает дифференцирующей активностью при действии на клетки HL-60, поскольку содержит дифференцирующий фрагмент TGENHR. Однако, в отличие от фактора дифференцировки, он не способен деструктурировать нуклеиновые кислоты и не обладает цитотоксической активностью при действии на интактные клетки HL-60. Наоборот, при трансфекции его внутрь клеток HL-60 с помощью унифектина [5] происходит возрастание пролиферации. На HLDFß были получены полик-лональные антитела, которые, хотя и взаимодействовали с фактором дифференцировки HLDF в опытах in vitro (ELISA, иммуноблоттинг), при им-муногистологическом окрашивании клеток HL-60 проявляли другой тип окрашивания. Если антитела к HLDF специфически окрашивали цитоплаз-
матическую мембрану и ядро клеток линии ИЬ-60, введенных в апоптоз или индуцированных к диф-ференцировке [6], то антитела к ИЬБрр окрашивали наряду с цитоплазматической мембраной еще и крупные органеллы - митохондрии, но не окрашивали ядро клеток. Такое различие в специфичности окрашивания подтверждается расчетами по методу анализа информационной структуры, позволяющему выделять иммуногенные участки в полипептидной цепи [7]. Используя антитела на ИЬБрр, было решено проверить, экспрессирует-ся ли в клетках белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью псевдогена, или же антитела взаимодействуют с каким-то другим белком.
Целью данного исследования было выделение из митохондрий клеток ИЬ-60, природного белка, иммунореактивного к полученным антителам, а также его характеризация и экспрессия.
Выделение белка из митохондрий клеток ИЬ-60 осуществляли с помощью аффинной хроматографии на колонке 8ерЬаго8е 4В с иммобилизованными антителами к ИЬБрр. Выделенные митохондрии предварительно солюбилизировали 1% октилгли-козидом. Электрофоретический анализ фракции, полученной после аффинной хроматографии, показал ее неоднородность: она содержала три полосы, электрофоретическая подвижность которых соответствовала ~30, ~20 и ~6 кДа. Но только белки с молекулярной массой ~20 и ~6 кДа давали положительную реакцию с антителами на ИЬБрр. Автоматическая деградация по методу Эдмана препаратов этих белков, предварительно перенесенных с помощью электроблоттинга на поливениленди-фторидную мембрану (РУБР), показала, что Ы-ко-нец ~20 кДа-белка закрыт, а пептид с М ~ 6 кДа имеет Ы-концевую последовательность УБР1ЕЕ-ОЕКУКЛ. Эта последовательность отсутствовала как в ИЬБР, так и в ИЬБрр.
Пептид УБРШЕОЕКУКА был синтезирован и на него были получены поликлональные антитела кролика. Эти антитела специфически выявляли только одну полосу с молекулярной массой ~20 кДа на электрофореграмме общего белкового экстракта клеток линии ИЬ-60, а также на имму-ноблоте солюбилизата митохондрий. Очевидно, что выделенный нами пептид с М ~ 6 кДа является продуктом ограниченного протеолиза белка с молекулярной массой ~20 кДа.
При помощи синтезированных комплиментарных друг другу вырожденных праймеров на нук-леотидную последовательность, кодирующую полипептид УБР1ЕЕОЕКУКЛ, а также прямого и обратного праймеров на последовательности, фланкирующие область гетерогенных кДНК-вставок вектора рАСТ2, в библиотеке тотальной кДНК из клеток линии ИЬ-60 на основе вектора рАСТ2 (библиотека была создана в нами ранее [6])
был получен фрагмент кДHK. Этот фрагмент кДHK кодировал белок с M ~20 кДа, состоящий из 165 а. о. (рис. 1). В его состав входил пептид VD-PIEEGEKVKA. Этот белок был нами назван гапо-нин (haponin - HLDF-alike protein).
C использованием праймеров на концевые области фрагмента ДИ^ соответствующего полноразмерному гапонину (см. рис. 1), в ходе ПЦР был получен фрагмент размером ~ 500 п. о., который был последовательно клонирован в Т-вектор pGEM®-T Easy (Promega, США), а затем в вектор для экспрессии pET11-a(+) (Novagen, США) по сайтам NdeI-BamHI. В качестве прямого прайме-ра использовали (5') TAC CAT ATG TCT CAG-GCC ACC AAG AGG AAG C (подчеркнут сайт расщепления рестриктазой NdeI, жирным шрифтом выделен стартовый ATG-кодон), в качестве обратного - (5') TCT GGATCC TCA GGC TGC-CTC CTC CTC TTC ACT C (подчеркнут сайт ре-стриктазы BamHI, жирным шрифтом выделен терминирующий TАG-кoдoн).
Полученный рекомбинантный гапонин был очищен в две стадии с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Препарат рекомбинантного гапонина давал положительную иммунохимическую реакцию с поликлональ-ными антителами на синтетический пептид VDPIEEGEKVKA, он, так же как и природный га-понин, выявлялся в виде уникальной полосы с M ~20 кДа (рис. 2). ^оме того, рекомбинантный белок окрашивался в иммуноблоте и антителами, полученными на HLDFß, что объясняется наличием общей антигенной детерминанты SLQK в этих белках. ^оме этой короткой последовательности, гомологии в структурах гапонина и HLDFß выявлено не было (рис. 1). С другой стороны, анализ последовательности ^HK гапонина показал гомологию с представителями семейства рибосомальных белков eS21 млекопитающих, эу-кариотическим фактором инициации трансляции eIF1a и полную идентичность с последовательностью ^HK гипотетического белка человека MGC11102 (PubMed Accession number EAW74481), одного из вероятных партнеров взаимодействия в двугибридной системе с фактором транскрипции STAT1 [8, 9], важнейшим белком регуляции го-меостаза клеток иммунной системы, и в первую очередь Т-лимфоцитов [10].
Данная работа выполнялась при финансовой поддержке гранта Международного научно-технического центра (проект 2641) и гранта Российской академии наук по молекулярной и клеточной биологии.
БИOOРГАHИЧECKАЯ ХИМИЯ том 33 < б 2007
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ НОВОГО БЕЛКА ГАПОНИНА
655
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность кДНК и выведенная аминокислотная последовательность белка гапонина. Подчеркнута последовательность, соответствующая структуре пептида с М 6 кДа, выделенного из митохондрий клеток ИЬ-60, а также праймеры, используемые для создания экспрессирующей конструкции. Взята в рамку последовательность, идентичная последовательности ИЬВБр. & - сигнал терминации трансляции.
кДа 75503525-
15-
10-
Рис. 2. SDS-Электрофорез (1) и иммуноблоттинг (2,3) фракции белка гапонина после ионообменной хроматографии на колонке MONO Q. 1 — электрофорез в 15% ПААГ; 2 — иммуноблоттинг с использованием поликлональных антител на HLDFP; 3 — иммуноблоттинг с использованием поликлональных антител на синтетический пептид VDPIEEGEKVKA.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Костанян И.А., Астапова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М., Липкин В.М. // Биоорган. химия 1995. Т. 21. С. 243-248.
2. Dranitsyna SM., Kostanyan I.A., Andreeva S.G., As-tapova M.V., Babichenko I.I., Baeva O.V., Boga-chukA.P., Molotkovskaya IM., Rodionov IL, Smirno-va E.V., Lipkin VM. // Russ. J. Bioorgan. Chem. 2000. V. 26. P. 306-316 (Драницына С.М., Костанян И.А., Андреева С.Г., Астапова М.В., Бабиченко И.И., Баева О.В, Богачук А.П, Молотковская И.М., Родионов И.Л., Смирнова Е.В., Липкин В.М. // Биоорган. химия. 2000. Т. 26. С. 340-351).
3. Kostanyan IA., Astapova M. V., Navolotskaya E. V., Lep-ikhova T.N., Dranitsyna S.M., Telegin G.B., Rodionov I.L
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.