УДК 577.152.1
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА S7VKOR -БЕЛКА ИЗ ТОМАТОВ (So7anum 7ycopersicum), СИНТЕЗИРУЮЩЕГО ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ. БИОИНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ VKOR РАСТЕНИЙ***
© 2014 Чан-Мей Ван1#, Ксяо-Джян Янг1#, Джиа-Джиа Ду1, Йинг Лу1, Жи-Бо Ю1, Юе-Гуанг Фенг2, Ксияо-Юн Ванг1,3***
1 College of Life Science, Shandong Agricultural University,
Taian 271018, Shandong, People's Republic of China; fax: +86 538 8242217, E-mail: xyunwang@sdau.edu.cn 2 Jinan Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250300, Shandong, People's Republic of China 3 State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong, People's Republic of China
Поступила в редакцию 11.12.13
Белки-гомологи эпоксид-редуктазы витамина К (VKOR) широко представлены в тканях растений, но до сих пор изучается лишь VKOR из Arabidopsis thaliana. В представленной работе была клонирована последовательность кодирующего района VKOR из Solanum lycopersicum (JF951971 в GenBank). Ей соответствовал белок (S/VKOR), состоящий из трансмембранного домена VKOR и дополнительного немембранного тиоре-доксин (Тгх)-подобного домена. Анализ, выполненный с использованием методов биоинформатики, показал, что первые 47 ^-концевых аминокислот молекулы белка S/VKOR функционируют в качестве транзитного пептида, позиционирующего этот белок в хлоропластах. Методом вестерн-блоттинга было показано, что S/VKOR локализован в мембране тилакоидов, причем его Trx-домен расположен на их освещенной поверхности. Моделирование трехмерной структуры S/VKOR показало, что его конформация аналогична кон-формации VKOR из Arabidopsis и цианобактерий: пять трансмембранных сегментов VKOR-домена и типичный Trx-подобный домен на освещенной стороне. Результаты функционального анализа свидетельствовали о том, что полноразмерный двухдоменный SlVKOR, лишенный транзитного пептида, мог катализировать реакцию синтеза дисульфидных связей. Сходные по структуре ^-концевые транзитные пептиды выявлены и в других белках VKOR растений, причем, в соответствии с нашим прогнозом, мишени большинства из них находятся в хлоропластах. Сравнение аминокислотных последовательностей и структур белков VKOR из различных растений показало, что все они состоят из двух доменов: трансмембранного VKOR и немембранного Trx-подобного, каждый из которых содержит по четыре консервативных остатка цистеина. Сделанный нами прогноз позволяет отнести эти Cys к функциональным, участвующим в реакции синтеза внутримолекулярных дисульфидных связей в белках-субстратах.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Solanum lycopersicum, VKOR растений, локализация в хлоропластах, биоинформационный анализ, синтез дисульфидных связей.
Эпоксид-редуктаза витамина К (УКОЯ) является интегральным мембранным белком и широко представлена в эндоплазматическом ре-тикулуме млекопитающих. Она восстанавливает
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-345, 23.02.2014.
** Приложение опубликовано на сайте «Biochemistry» (Moscow), Vol. 79, issue 5, 2014.
*** Адресат для корреспонденции. # Эти авторы внесли равный вклад в работу.
витамин К, участвующий в декарбоксилирова-нии, и, тем самым, активирует витамин К-зави-симые белки, вовлеченные в процесс свертывания крови и являющиеся мишенями для известного антикоагулянта — зоокумарина [1].
Гомологи УКОЯ содержатся во внутренних мембранах тилакоидов большинства фотоавто-трофных цианобактерий. В отличие от УКОЯ животных белки цианобактерий состоят из двух доменов: ^-концевого мембранного домена, гомологичного каталитической субъединице УКОЯ
из тканей млекопитающих, и С-концевого немембранного тиоредоксин (Trx)-подобного домена, гомологичного катализирующему синтез дисульфидных связей белку DsbA из Escherichia coli [2]. Было продемонстрировано [3], что такой двухдоменный белок участвует в синтезе ди-сульфидных связей у фотосинтезирующих окси-генных организмов и необходим для их нормального фотоавтотрофного роста; мутантные линии с дефицитом гена VKOR плохо развиваются в фотоавтотрофных условиях при нормальном освещении.
Недавно был идентифицирован VKOR у Arabidopsis, он кодируется геном At4g35760 и по своему строению аналогичен белкам VKOR из цианобактерий [4]. Эксперименты с использованием гибридного GFP (зеленый флуоресцирующий белок)—VKOR показали, что 45 его N-кон-цевых аминокислот функционируют как транзитный пептид, обеспечивающий локализацию белка VKOR в пластидах; методом вестерн-блот-тинга было подтверждено присутствие VKOR в тилакоидах клеток Arabidopsis [5, 6].
Предполагается существование двух сходных топологических моделей VKOR из Arabidopsis (AtVKOR-DsbA). В соответствии с первой моделью молекула белка содержит четыре трансмембранные спирали и одну полупогруженную в мембрану спираль, а ее N- и С-концевые участки находятся в окисляющей среде в условиях освещения [6]. Другая модель предусматривает наличие пяти трансмембранных спиралей и N-кон-ца, локализованного в строме в редуцирующих условиях; С-конец при этом располагается на свету [7]. Обе модели подразумевали, что все функциональные остатки цистеина и Тгх(тиоре-доксин)-подобный домен белка находятся в окисляющем окружении. И обе они вполне согласовались с трехмерной (3D) структурой молекулы VKOR из Synechococcus, полученной при рентгеноструктурном анализе кристаллов этого белка [2].
Установлено, что, подобно белкам DsbA и DsbB из E. coli, VKOR из Arabidopsis может катализировать реакцию синтеза дисульфидных связей [6, 7]. В этом процессе участвуют восемь консервативных остатков цистеина: четыре — в домене VKOR и четыре — в Trx-подобном домене [6]. В процессе катализа двухдоменный белок VKOR из Arabidopsis осуществляет перенос электронов. При этом Trx-подобный домен молекулы белка может функционировать в качестве донора электронов для встроенного в мембрану домена VKOR, в то время как VKOR-домен либо его свободный аналог могут эффективно опосредовать дитиотреитол-зависимое восстановление филлохинона и менахинона до их со-
ответствующих гидрохиноновых форм [5]. Установлено также, что Trx-подобный домен VKOR из Arabidopsis обладал редуктазной, оксидазной и изомеразной активностями in vitro и мог ускорять синтез дисульфидных связей в светочувствительных белках [7, 8].
Растения Arabidopsis, несущие мутантные формы белка VKOR, обнаруживают различные дефекты роста и развития [7, 8]. По сравнению с растениями «дикого» типа они низкорослые, светло-зеленого цвета, мелколиственные, с короткими междоузлиями [7]. Белок VKOR необходим организму Arabidopsis для самосборки фотосистемы II, а также играет важную роль в регуляции окислительно-восстановительных реакций и в гомеостазе реактивных форм кислорода [8].
Гомологи белка VKOR широко представлены в различных растениях, однако до сих пор его изучение ограничивалось исследованиями Arabidopsis tha/iana. Сравнение первичных последовательностей показало, что VKOR томатов (ABA41597) и A. tha/iana довольно сильно различаются между собой. Вместо двухдоменного белка последовательность ABA41597 кодирует только короткий трансмембранный район этого белка (данные NCBI — Национального центра биотехнологической информации). В своей работе мы попытались клонировать последовательность ABA41597, но в результате получили лишь ее укороченную форму. Поэтому, используя метод быстрой амплификации концов кДНК (RACE), мы клонировали полноразмерную кДНК VKOR из Solanum lycopersicum и анализировали ее функционирование и расположение в геноме. Используя методы биоинформатики, мы изучили различные VKOR растений с целью выяснения их функционирования, локализации и структуры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Растительный материал, линии бактерий и условия их культивирования. Самоопыляющиеся сорта желтых томатов (были подарены мисс Ксижен Аи) выращивали в закрытом грунте при освещении 120 мкмоль/м2/с при 26° в цикличном режиме смены день/ночь = 16/8 ч. Линии бактерий и главные характеристики их генотипов приведены в табл. 1. Бактерии культивировали в среде LB или минимальной среде M63, содержавшей глюкозу и соответствующие антибиотики [9].
Клонирование гена SlVKOR. Гомологи аминокислотной последовательности VKOR томатов были идентифицированы в ходе поиска в NCBI
Таблица 1. Штаммы бактерий, использованные в работе
Штамм Характеристика генотипа
DHB4 araD139A(ara-leu)7697 lacX74 рИоАА[РуиП] phoR malF3 galE galK thi rpsL F'lacIQ pro
HK295 F-Dara-714galUgalKD(lac)X74 rpsL thi [25]
HK361 HK295Adsb^(malF-lacZ102, Kmr)
HK325 HK295AdsbB (malF-lacZ102, Kmr)
HK329 HK295AdsbAB [26]
Mer600 HK295AdsbAB(malF-lacZ102, Kmr)
Blast против последовательности, кодирующей белок VKOR из Arabidopsis (регистрационный номер At4g35760 в GenBank). Из листьев томатов была экстрагирована суммарная фракция клеточной РНК и использована в качестве матрицы для амплификации SlVKOR с использованием праймеров P1 и P2 (табл. 2). Секвенирова-ние последовательности показало, что полученный ген не содержит терминирующий кодон. Поэтому мы спроектировали внутренний и внешний праймеры и методом RACE удлинили 3'-конец гена SlVKOR с помощью праймера Р3. И, наконец, были спроектированы полноразмерные праймеры Р4 и Р5, и с их помощью был клонирован полноразмерный ген SlVKOR при использовании кДНК в качестве матрицы.
Изучение локализации белка S7VKOR. Для прогнозирования места локализации SlVKOR было использовано онлайн-программное обеспечение, а затем был проведен фактический поиск этого белка в тилакоидах и строме клеток томатов. Для этого свежесорванные листья растений Solanum lycopersicum сначала измельчали в 10 объемах буфера для лизиса (20 мМ HEPES-KOH, pH 7,5; 10 мМ ЭДТА) и инкубировали во льду в течение 30 мин. Смесь центрифугировали при 42 000 g в течение 30 мин при 4° и получали фракции стромы и тилакоидов из супернатанта и осадка соответственно [10]. После проведения Ds-Na-ПААГ-электрофореза белки обоих фракций переносили на поливинилидендифторид-ные мембраны (PVDF) и идентифицировали с помощью анти-VKOR антител («Genscript», Нанкин, Китай), антител против активатора рибуло-зо-1,6-дифосфаткарбок
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.