научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ К+-КАНАЛОВ TREK-2 В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА Биология

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ К+-КАНАЛОВ TREK-2 В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА»

УДК 577.352.465

ИДЕНТИФИКАЦИЯ К+-КАНАЛОВ TREK-2 В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

© 2014 г. М. В. Тарасов1, П. Д. Котова1, О. А. Рогачевская1, В. Ю. Сысоева2, С. С. Колесников1*

Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3; *электронная почта: staskolesnikov@yahoo.com 2Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,

119192, Москва, Ломоносовский просп., 31, корп. 5 Поступила в редакцию 14.01.2014 г.

Ионные каналы, функционирующие в мезенхимальных стромальных клетках (МСК), могут играть существенную роль в поддержании их плюрипотентности и инициации процессов пролиферации и дифференцировки. Между тем механизмы электрогенеза в МСК изучены недостаточно, мало что известно о спектре и свойствах ионных каналов, активных в покое и активирующихся при стимуляции МСК. Используя элетрофизиологические подходы и ингибиторный анализ, нами исследовались ионные каналы, функционирующие в МСК и, в частности, каналы, активные в покое. В попытке оценить вклад хлорных каналов в потенциал покоя МСК использован широкий набор ингибиторов анионного транспорта, в том числе нифлумовая кислота (МБЛ). В большинстве случаев КБЛ вызывала гиперполяризацию МСК, что сопровождалось увеличением интегральной проводимости. Этот эффект, отсутствующий в условиях диализа клеток раствором С8С1, не мог быть обусловлен блокадой хлорных каналов. Полученные данные свидетельствовали о том, что основной мишенью КБЛ были не хлорные каналы, а К+-каналы, которые стимулировались этим агентом. МЕЛ-стимулируемый К+-ток блокировался дилтиаземом и потенцировался при добавлении ионов меди во внеклеточный раствор и при закислении последнего. В своей совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что основной мишенью КБЛ в МСК являются К+-каналы типа ТКБК-2. Результаты регистрация электрической активности более 100 индивидуальных МСК позволяют предположить, что практически в каждой клетке К+-каналы ТЯБК-2 должны быть функциональны.

Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки человека, нифлумовая кислота, ТЯБК-2 К+-каналы.

Б01: 10.7868/80233475514030074

ВВЕДЕНИЕ

Все увеличивающийся интерес к исследованию мезенхимальных стволовых клеток преимущественно ассоциируется с задачами регенеративной медицины [1, 2]. Это обстоятельство определяет прикладную доминанту исследований в данной области физиологии клетки. В то же время представляется, что развитие фундаментальных исследований физиологических процессов в этих клетках необходимо не только для расширения весьма ограниченных на данный момент представлений об их рецепторных, сигнальных и транспортных системах, но и могло бы оказаться весьма полезным для решения прикладных задач. В частности, ионные каналы, функционирующие в мезенхи-мальных стволовых клетках, могут играть существенную роль в клеточном гомеостазе, поддержании их плюрипотентности и инициации процессов пролиферации и дифференцировки. Такая

возможность следует, например, из того, что ионные каналы детерминируют мембранный потенциал и вход наружного Са2+ и тем самым могут регулировать внутриклеточные Са2+ сигналы, определяющие митотические процессы и процессы секреции ключевых факторов роста и дифферен-цировки [3—5]. Следует также отметить, что канальные белки могут формировать макромолеку-лярные комплексы с рецепторами факторов роста и адгезивными рецепторами [6—9]. Между тем механизмы электрогенеза в мезенхимальных стволовых клеток изучены недостаточно, мало что известно о спектре и свойствах ионных каналов, активных в покое и активирующихся при стимуляции этих клеток. Лишь единичные работы были посвящены изучению электрической активности мезенхи-мальных стволовых клеток [10—12].

Существующие методы и подходы недостаточны для идентификации и эффективных исследо-

ваний физиологической активности мезенхи-мальных стволовых клеток в составе ткани. В силу этого в экспериментах обычно используют выделяемые из разных тканей стволовые клетки, которые идентифицируются по определенному набору молекулярных маркеров и поддерживаются в первичной культуре — так называемые мезен-химальные стромальные клетки (МСК) [13]. Нами исследовались механизмы электрогенеза в МСК из жировой ткани человека. В частности, была сделана попытка оценить вклад хлорных каналов в потенциал покоя МСК с использованием различных ингибиторов анионного транспорта, в том числе нифлумовой кислоты (niflumic acid, NFA). В большинстве случаев NFA вызывала гиперполяризацию МСК, что сопровождалось увеличением, а не уменьшением интегральной проводимости. Этот эффект отсутствовал в условиях диализа клеток раствором CsCl и не мог быть обусловлен блокадой хлорных каналов (данные не представлены). В данной работе мы приводим факты, свидетельствующие о том, что основной мишенью NFA были не С1--каналы, а К+-каналы TREK-2, которые стимулировались этим агентом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение МСК и их культивирование. Выделение МСК из подкожной жировой клетчатки человека и получение первичной культуры клеток подробно описано ранее [14]. Для культивирования МСК использовали пластиковые чашки Петри (Corning, США) и/или в 12-луночные планшеты и культуральную среду AdvanceStem™ (HyClone) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина. При достижении 80% монослоя клетки пересевали. Клетки обрабатывали раствором Версе-на (Sigma) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а затем рассаживали в разведении 1 : 4. В экспериментах использовали МСК после 2— 4 пассажа. Перед экспериментом клетки культивировали в среде (см. выше) без антибиотиков в течение 12 ч. Затем клетки двукратно промывали раствором Версена (Sigma). Для отделения от субстрата клетки инкубировали 3—5 мин в 200 мкл фермента HyQTase (HyClone). Фермент ингиби-ровали добавлением 800 мкл полной ростовой среды, клетки ресуспендировали и помещали в пластиковую пробирку. Клетки осаждали центрифугированием при 0.8 g в течение 45 с и хранили в течение 2—3 ч при комнатной температуре (22— 24°C). По мере необходимости часть клеток переносили пластиковой пипеткой в электрофизиологическую камеру, описанную ранее [15].

Электрофизиология. Электрическую активность МСК регистрировали методом patch-clamp в конфигурации perforated patch с использованием усилителя Axopatch 200B, ЦАП-АЦП конвер-

тера Digidata 1322A и пакета лицензионных программ pClamp8.0 (все Axon Instruments, США). Клетки в электрофизиологической камере визуализовали с использованием микроскопа Axioscop-2 (Carl Zeiss, Германия) и объектива LD A-Plan 32х. Базовый внутриклеточный раствор содержал (в мМ): 140 KCl, 1 MgSO4, 0.1 EGTA, 10 HEPES-KOH (KOH); pH 7.3. В случае whole-cell регистраций в раствор добавляли 1 мМ MgATP; в случае perforated patch — амфоте-рицин В (Amphotericin B, 400 мкг/мл). Базовый внеклеточный раствор содержал (в мМ): 135 NaCl, 5 KCl, 0.8 MgSO4, 2 CaCl2, 10 HEPES—NaOH, pH 7.4. Система перфузии [15] обеспечивала смену раствора камеры со скоростью 0.1—1 мл/с. Опыты проводили при комнатной температуре (22—24°C).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В общей сложности нами было исследовано 136 МСК, и в 86 случаях регистрации были достаточно стабильными, чтобы надежно оценить электрофизиологические характеристики клеток. С целью предотвращения потери внутриклеточных компонент и пролонгирования регистраций обычно использовался метод perforated patch в двух вариантах: фиксация потенциала для получения вольт-амперных характеристик и фиксация нулевого тока для измерения потенциала покоя клеток. При псевдофизиологическом ионном градиенте на плазматической мембране (140 мМ KCl/135 мМ NaCl) входное сопротивление клеток варьировало в пределах 0.5—3 ГОм, а потенциал покоя составлял —30...—10 мВ. Такая величина потенциала покоя свидетельствовала о том, что МСК электрически невозбудимы. И действительно, потенциал-зависимые Na+- и Ca2+-каналы, характерные для нейрональных или мышечных клеток, не были нами зарегистрированы ни в одной из исследованных клеток.

Согласно литературным данным, потенциал покоя клеток формируется при участии ряда специализированных ионных каналов, активных в покое, таких как ^-каналы с двухдоменной порой (two-pore domain, K2P) [16], C^-каналы ClC-типа [17, 18], неселективные катионные каналы [19, 20] и №+-каналы утечки [21]. Небольшой по величине потенциал покоя указывал на то, что относительная активность К+-каналов в покоящихся МСК невелика и что ионные токи через другие каналы с положительным или близким к нулю потенциалом реверсии играют существенную роль в установлении потенциала покоя в этих клетках. В частности, это могли быть анионные каналы. Чтобы оценить их вклад, нами исследовались эффекты различных блокаторов анионных каналов на потенциал покоя МСК, включая SITS (4-acetamido-4'-isothiocyanato-2,2'-stilbenedi-sulfonic acid), DITS (4,4'-diisothiocyanato-2,2'-stil-

500 мкМ NFA

В

«

о

к

о С

4 се

5

Ее -60

20

-40

S

о

С

-80

Рис. 1. Репрезентативный ответ МСК на аппликацию нифлумовой кислоты (МЕЛ) (500 мкМ). Время аппликации показано горизонтальной линией над кривой регистрации мембранного потенциала, выполненной в режиме фиксации нулевого тока.

80 мВ

-40 мВ

А

«

M о н

=s

3 «

Л

4 се Л

1-е

£ «

И

500 мкМ NFA

Отмывка

80 -40 0 40 80

Мембранный потенциал, мВ

Отмывка

Рис. 2. Нифлумовая кислота (NFA) стимулирует активность К+-каналов МСК. а—в — Репрезентативное семейство интегральных токов, регистрируемых в МСК в контроле (а), после аппликации 500 мкМ NFA (б) и после отмывки (в). Клетка поддерживалась при потенциале —40 мВ и поляризовалась электрическими импульсами длительностью 150 мс в пределах от — 100 до 80 мВ (верхняя панель в а). г — Вольт-амперные (I—V) характеристики клетки в контроле, после аппликации 500 мкМ NFA и после отмывки. Моменты измерения стационарных токов для получения I— V-кривых отмечены соответствующими символами на записях а—в. Уровень нулевого тока обозначен пунктиром. Потенциал реверсии интегрального тока в контроле и в присутствии NFA составляет ~0 и —72 мВ соответственно. Электрод сод

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком