БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2012, том 38, № 5, с. 400-408
УДК 591.81:593.96 БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
идентификация клеточных субпопуляций
гемоцитов MODIOLUS KURILENSIS (BERNARD, 1983) (BIVALVIA: MYTILIDAE) МЕТодАМи проточной
цитометрии и световой микроскопии1
© 2012 г. А. А. Анисимова
Дальневосточный федеральный университет, Владивосток 690950 e-mail: anisan77@mail.ru
Статья принята к печати 29.03.2012 г.
Применение метода проточной цитометрии с использованием параметров переднего и бокового светорассеяния позволило идентифицировать в гемолимфе двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis (Mytilidae) три основные клеточные субпопуляции, которые, согласно данным контрольного микроскопического анализа, соответствуют четырем морфотипам гемоцитов: регион R1 - гемобласты и агранулоциты (гиалиноциты), регион R2 - полугранулоциты, регион R3 - гранулоциты. Гемобласты, агранулоциты и полугранулоциты обнаруживали базофильный характер эндоплазмы, в то время как гранулоциты преимущественно окрашивались эозинофильно. Пропорция клеток разных морфотипов и степень дискретности их распределения на субпопуляции существенно варьировали у разных особей, отражая, по-видимому, различия функциональной активности гемоцитов в зависимости от иммунологического статуса животных.
Ключевые слова: гемолимфа, гемоциты, проточная цитометрия, светорассеяние, Modiolus kurilensis, Mytilidae, Bivalvia.
Flow cytometric and light microscopic identification of hemocyte subpopulations in Modiolus kurilensis (Bernard, 1983) (Bivalvia: Mytilidae). A. A. Anisimova (Far Eastern Federal University, Vladivostok 690950)
Flow cytometry using forward and side light scattering identified three cell subpopulations in the hemolymph of Modiolus kurilensis (Mytilidae). Light microscopic data indicated that they correspond to four hemocyte morphotypes: R1, hemoblasts and agranulocytes (hyalinocytes); R2, semigranulocytes; and R3, granulocytes. Hemoblasts, agranulocytes, and semigranulocytes displayed a basophilic endoplasma, while granulocytes were mainly eosinophilic. The proportion of the different cell morphotypes and the level of subpopulation distinction substantially varied among individuals. This seems to be connected with the different functional activity of the hemocytes, depending on the immunological status of bivalves. (Biologiya Morya, 2012, vol. 38, no. 5, pp. 400-408).
Key words: hemolymph, hemocytes, flow cytometry, light scattering, Modiolus kurilensis, Mytilidae, Bivalvia.
Гемоциты двустворчатых моллюсков участвуют в разнообразных физиологических процессах, направленных на поддержание организменного гомеостаза: в реализации иммунного ответа, нейроэндокринной регуляции, переносе и переваривании питательных веществ и др. (см. обзоры: Cheng, 1981, 2000; Sminia, van der Knaap, 1987; Chu, 2000; Canesi et al., 2002; Ottaviani, 2006; Donaghy et al., 2009b; Koutsogiannaki, Kaloyianni, 2010). Столь существенная роль этих клеток в обеспечении жизненно важных функций объясняет неослабевающий интерес исследователей к их всестороннему изучению. Интерес усиливается и тем, что двустворчатые моллюски являются объектами промысла и аквакульту-ры, а также широко используются в целях биоиндикации и экологического мониторинга.
Гемоциты Bivalvia традиционно делят на два основных морфотипа - гранулоциты и агранулоциты (гиалиноциты), при этом у большинства изученных ви-
дов различают еще и малые агранулоциты (малые гиалиноциты) - бластоподобные клетки, рассматриваемые как камбиальный резерв клеточной популяции (Cheng, 1981; Sminia, van der Knaap, 1987; Hine, 1999; Canesi et al., 2002; Donaghy et al., 2009b). Гранулярные и аграну-лярные клетки имеют сходный набор ферментов, в той или иной мере способны к адгезии, фагоцитозу, продукции активных форм кислорода и цитотоксической деятельности (Lopez et al., 1997b; Ottaviani et al., 1998; Cima et al., 2000; Matozzo et al., 2007; Donaghy et al., 2009а), производят одинаковые сигнальные молекулы (Ottaviani et al., 1998). Однако гранулоциты, содержащие в цитоплазме большое количество лизосом и секреторных гранул, наиболее активны в проявлении иммунных реакций (Sminia, van der Knaap, 1987; Carballal et al., 1997а; Lopez et al., 1997с; Pipe et al., 1997; Hine, 1999; Canesi et al., 2002; Wootton et al., 2003; Goedken, DeGuise, 2004; Garcia-Garcia et al., 2008; Donaghy et al., 2009а), в то
1 Работа выполнена в рамках Государственного контракта № 02.740.11.0678, гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ-64869.2010.4 и гранта Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, договор № 11.G34.31.0010.
время как агранулоциты в большей степени вовлечены в производство внеклеточного матрикса и поддержание гемостаза (Suzuki et al., 1991).
Таким образом, современная классификация ге-моцитов двустворчатых моллюсков построена на основе таких признаков, как клеточный размер и характер цитоплазматических включений. Это позволяет дифференцировать разные морфотипы циркулирующих клеток Bivalvia не только с помощью микроскопического анализа (Mix, 1976; Moore, Lowe, 1977; Дзюба, Романова, 1992; Russell-Pinto et al., 1994; Cajaraville, Pal, 1995; Lopez et al., 1997а; Pipe et al., 1997; Ottaviani et al., 1998; Hine, 1999; Cima et al., 2000; Pampanin et al., 2002; Wootton, Pipe, 2003; Matozzo et al., 2007, и др.), но и методом проточной цитометрии с использованием параметров светорассеяния (Ford et al., 1994; Ashton-Alcox, Ford, 1998; Xue et al., 2001; Allam et al., 2002; Hégaret et al., 2003; Goedken, DeGuise, 2004; Hégaret, Wikfors, 2005; Parisi et al., 2008; Donaghy et al., 2009а; Mateo et al., 2009; Hégaret et al., 2010; Li et al., 2010). В условиях проточной цитометрии показатель переднего светорассеяния отражает размер клеток, а величина бокового светорассеяния - степень их внутренней неоднородности (зернистости). Высокая скорость анализа и возможность одновременного учета нескольких параметров определяют перспективность использования проточной цитометрии для быстрой и объективной оценки иммунологического статуса моллюсков в экспериментальных и мониторинговых исследованиях.
В настоящей работе предпринята попытка охарактеризовать морфологические параметры гемоцитов двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis (Bernard, 1983), сочетая методы проточной цитометрии и световой микроскопии. Несмотря на изученность клеточного состава гемолимфы других видов митилид (Moore, Lowe, 1977; Cajaraville, Pal, 1995; Carballal et al., 1997а, b, 1998; Pipe et al., 1997; Ottaviani et al., 1998; GarciaGarcia et al., 2008; Parisi et al., 2008; Ciacci et al., 2009, 2010), аналогичные данные для модиолусов в литературе отсутствуют. Между тем, M. kurilensis является типичным и массовым представителем бентосных экосистем северной части Японского моря, что вызывает определенный интерес к этому объекту с точки зрения региональных исследований в области экологического мониторинга.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В работе использовали 16 половозрелых особей Modiolus kurilensis с длиной раковины от 7 до 9 см, собранных в летний сезон (июль 2010 г.) в зал. Петра Великого Японского моря.
Забор гемолимфы производили с помощью шприца из заднего аддуктора с добавлением одного объема 0.3 М раствора натриевой соли ЭДТА (рН 7.7) на 9 объемов гемолимфы для предотвращения агглютинации гемоцитов. Полученные пробы фиксировали равноценным объемом охлажденного 8% водного раствора параформальдегида (ПФА) (конечная концентрация ПФА в клеточной суспензии составляла 4%) в течение 1
ч при 4°С. После завершения фиксации образцы гемолимфы центрифугировали (~ 800 g, 15 мин), осторожно удаляли надо-садочную жидкость и трехкратно отмывали клетки изоосмо-тическим (3.4%) раствором NaCl. После последней отмывки фиксированные клетки обезвоживали в серии растворов этанола повышающейся концентрации (30, 50, 70%) и переводили для хранения в свежую порцию 70% этанола.
Для цитофлуорометрического определения содержания ДНК в ядрах гемоцитов непосредственно перед анализом клеточные суспензии окрашивали иодидом пропидия. Для окраски образцов готовили буфер на основе фосфатно-буферной солевой среды (ФБС) (рН 7.4), содержащий 0.2% Triton Х-100, 0.1% рибонуклеазы А (100 мкг/мл при активности 86 ед. Кунитца на 1 мг белка) и 0.05% иодида пропидия (50 мкг/мл). Перед окрашиванием клетки дважды отмывали от этанола с помощью ФБС и инкубировали с окрашивающим буфером в течение 30 мин при 37°С. После двукратной отмывки от красителя с помощью ФБС клетки тщательно ресуспензировали в третьей порции буфера и сразу анализировали методом проточной цитометрии. Объем каждого образца составлял 500 мкл клеточной суспензии с концентрацией 104-105 клеток в 1 мл.
Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur (Becton Dickinson, США) при возбуждении аргоновым лазером (длина волны 488 нм) с помощью программного обеспечения CellQuest. Измеряли по 10 000 событий (отдельных сигналов от клеток и прочих частиц в суспензии) от каждого образца. Анализировали сигналы переднего и бокового светорассеяния в каналах FSC (forward scattering) и SSC (side scattering), соответственно, для построения двухпа-раметрических гистограмм распределения клеток по размерам и степени зернистости (FSC vs SSC). Для дифференциации одиночных клеток от посторонних частиц и клеточных агрегатов в окрашенных пробах измеряли интенсивность флуоресценции иодида пропидия в канале FL3 (красная флуоресценция). В качестве негативного контроля были использованы неокрашенные фиксированные клетки. При цитофлуорометри-ческом анализе параллельно оценивали два параметра флуоресцентного сигнала - площадь под сигналом (FL3-A) и высоту сигнала (FL3-H). Для одиночных клеток площадь сигнала прямо пропорциональна его высоте (диаметр ядра увеличивается прямо пропорционально содержанию ДНК), в то время как для агрегатов эта пропорция носит другой характер (Allen, Newland, 2001).
Для микроскопического анализа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.