БИОХИМИЯ, 2012, том 77, вып. 5, с. 533 - 543
УДК 612.014.461+577.352.462
ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВОЙ М23А мРНК АКВАПОРИНА-4 МЫШИ, КОТОРАЯ ЭКСПРЕССИРУЕТСЯ В МОЗГЕ, ПЕЧЕНИ И ПОЧКЕ*
© 2012 г. Т.Ю. Аликина1**, Н.Б. Илларионова2, С.М. Зеленин2, А.А. Бондарь1
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8; факс: +7(383)363-5115, электронная почта: alikina@niboch.nsc.ru
2Karolinska Institutet, ALB KS, Q2:09, 17176 Stockholm, Sweden; fax: +468-51777328, E-mail: nina.illarionova@ki.se
Поступила в редакцию 16.12.11 После доработки 02.02.12
Аквапорины (AQP) — это семейство трансмембранных белков (водных каналов, которые проницаемы для молекул воды по осмотическому градиенту). AQP4 мыши экспрессируется в виде двух изоформ (М1 и М23), от соотношения которых в клетке зависит водная проницаемость ее цитоплазматической мембраны. Эти две изоформы AQP4 мыши кодируются тремя мРНК: М1-изоформа кодируется М1 мРНК, а М23-изофор-ма кодируется М23 и М23Х мРНК. В данной работе идентифицирована новая, четвертая форма мРНК AQP4 мыши (М23А) с отличным от других мРНК этого водного канала стартом транскрипции. 5'-Конец М23А мРНК кодируется четырьмя ранее неизвестными экзонами А, В, C и D, локализованными в 5'-обла-сти от экзона-0 гена AQP4 мыши. Альтернативный сплайсинг в области экзонов A, B, C и D приводит к образованию множественных вариантов М23А мРНК, из которых мы клонировали шесть. Все они кодируют полноразмерную М23-изоформу AQP4. С помощью ОТ-ПЦР выявлены различия в тканеспецифичности экспрессии новой М23А и других мРНК AQP4 мыши. Новая М23А мРНК экспрессируется преимущественно в почке, печени и мозге мыши. Компьютерный анализ структурных особенностей 5'-нетранслируемой области (5'-UTR) мРНК AQP4 выявил низкую эффективность трансляции для М1 мРНК и высокую для М23А, М23Х и М23 мРНК. Мы предполагаем, что экспрессия AQP4 тканеспецифично контролируется независимыми альтернативными промоторами гена. Возможно, существование нескольких мРНК AQP4 является отражением неизвестного долговременного механизма тканеспецифичной регуляции содержания М1- и М23-изоформ водного канала в цитоплазматической мембране клетки, соотношение которых, как полагают, влияет на ее водную проницаемость в целом.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: аквапорин-4, мРНК, ген, экзон, альтернативный сплайсинг, мышь.
Аквапорин-4 (ЛрР4) — представитель семейства трансмембранных белков (водных каналов) — обеспечивает пассивный регулируемый транспорт исключительно молекул воды по осмотическому градиенту через мембрану клетки и играет важную роль в поддержании водного го-меостаза. ЛрР4 экспрессируется в ножках астро-цитов мозга, основных клетках собирательных протоков почки, клетках Мюллера сетчатки глаза, эпителии легких, слюнных железах, парие-
Принятые сокращения: AQP4 — аквапорин-4, а.о. — аминокислотный остаток, OAP — ортогональные массивы (ortogonal array particles), п.н. — пара нуклеотидов, UTR — нетранслируемая область.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 11-321, 25.03.2012.
** Адресат для корреспонденции.
тальных клетках желудка, холангиоцитах печени, эпителии тонкого и толстого кишечника, скелетных мышцах и кардиоцитах сердца [1, 2]. Полагают, что ЛрР4 регулирует водную проницаемость гематоэнцефалического барьера и играет критическую роль в развитии отека мозга [3]. Делеция Л&Р4 у нокаутных мышей уменьшает отек мозга после острой водной интоксикации и ишемического удара [4]. У человека экспрессия ЛрР4 в мозге возрастает при различных воспалительных процессах, ассоциированных с отеком [5]. Считается, что ингибирование ЛрР4 может стать новым терапевтическим средством для лечения отека мозга [3, 5].
У млекопитающих существуют две основные изоформы ЛРР4. Это М1 (323 аминокислотных остатка (а.о.)) и М23 (301 а.о.), которые отличаются наличием 22 а.о. на ^-конце М1-изоформы.
Белок AQP4 формирует тетрамеры водных каналов из мономеров М1 и М23. Уникальность AQP4 состоит в том, что гетеро- и монотетрамеры AQP4 образуют в плазматической мембране ортогональные массивы (ortogonal array partióles (OAP)) в отличие от других водных каналов [6]. У отдельных гомотетрамеров AQP4, состоящих только из M23- или из М1-полипептидов, отмечены либо сравнимые по величине осмотические водные проницаемости [6], либо большая для М1, чем для М23 [7]. Но когда М23-изоформа находится в составе OAP, это значительно повышает ее водную проницаемость в расчете на один канал по сравнению с таковой у М1 [8]. Соотношение изо-форм М1 : М23 зависит от типа ткани, например в астроцитах мозга оно составило 1 : 3 [6, 9]. Показано, что размеры OAP увеличиваются с ростом соотношения изоформ М23 : М1 [10]. Полагают, что организация AQP4 в виде OAP увеличивает на порядок удельную проницаемость массива каналов, а вместе с ним и клеточной мембраны, а различные уровни экспрессии двух изо-форм в клетках могут регулировать образование OAP [11]. Недавно в мозге крысы была обнаружена третья изоформа AQP4 — М2, которая на 41 а.о. длиннее с ^-конца, чем М1 [12]. М2 отсутствует у человека и мыши ввиду наличия стоп-кодонов в рамке считывания аналогичного района гена AQP4. Показано, что изоформа М2 сама не формирует OAP, но способна ассоциироваться с М23, формируя с ней гетеротетрамеры [13].
Соотношение изоформ белка AQP4 в клетке отражает уровни экспрессии соответствующих мРНК и зависит от эффективности их трансляции. Изоформа М1 у всех млекопитающих кодируется единственной М1 мРНК, а изоформа М23 может кодироваться несколькими мРНК, которые различаются 5'-нетранслируемой областью и имеют далеко разнесенные по гену разные старты транскрипции. Для AQP4 мыши были найдены две мРНК - М23 [14, 15] и М23Х, идентифицированная нами ранее [16, 17]. Считалось, что ген AQP4 мыши состоит из шести эк-зонов (0, Х, 1, 2, 3, 4), разделенных пятью инт-ронами. М23 мРНК кодируется экзонами-1, -2, -3 и -4. М23Х мРНК кодируется экзоном-Х, 5'-сплайсированным экзоном-1 и экзонами-2, -3 и -4. М1 мРНК кодируется экзоном-0, 5'-сплай-сированным экзоном-1 и экзонами-2, -3 и -4. Два кодона старта трансляции ATG для изоформ М1 (Мей) и М23 ^et23) находятся в одной открытой рамке считывания (ORF) и локализуются в экзонах-0 и -1 соответственно. Стоп-ко-дон для всех изоформ идентичен и расположен в экзоне-4. У других млекопитающих были найдены следующие гомологи мРНК AQP4: у человека — М1, М23 и ее укороченный вариант M23sv
[9, 18], у быка - М1 и М23Х [19], у овцы - М1 и М23 [20], у кенгуровой крысы - М1 и М23 [21]. Однако у крысы ЯйИт norvegicus было обнаружено шесть форм мРНК, три из которых — полноразмерные М1, М23Х и М2 мРНК, а еще три являются их делеционными вариантами, потерявшими экзон-2 в результате альтернативного сплайсинга, и кодируют функционально неполноценный белок АрР4 [12].
Ранее с помощью полуколичественного ОТ-ПЦР-анализа суммарной РНК из мозга, почки и легких взрослой и двухдневной мышей мы показали, что характер экспрессии М23 и М23Х мРНК, которые кодируют одну изоформу белка АрР4 М23, зависит от органа и возраста [16, 17]. Существует ряд факторов, влияющих на экспрессию гена AQP4:: гипоксия, гиперосмолярность, активация РКС, тестостерон, эстрадиол, эрит-ропоэтин [22—28]. Однако неизвестно, на транскрипцию каких именно форм мРНК они влияют. Вместе с тем водная проницаемость может эффективно регулироваться не только изменением общего уровня экспрессии АрР4, но и изменением соотношения между его изоформами. При использовании лабораторных животных как моделей для изучения заболеваний, ассоциированных с нарушением функционирования АрР4, а также механизмов регуляции экспрессии AQP4 следует учитывать видовые особенности организации гена и мРНК AQP4. Мы представляем новые данные о неизвестной ранее М23А-форме мРНК и четырех новых экзо-нах гена AQP4 мыши (А, В, С и Б), существенно меняющие представление о его структурно-функциональной организации у мыши.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Секвенирование ДНК. ОТ-ПЦР-Фрагменты разделяли с помощью электрофореза в агароз-ном геле, выделяли с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit («Qiagen», Германия) и секве-нировали методом Сэнгера с помощью наборов BigDye Terminator Ready Reaction Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) с использованием для 15—20 мкл реакции секвенирования 0,5—1,0 мкл BigDye-реагента, 0,3—0,5 пмоль ДНК, 5 пмоль праймера и соответствующего количества 5-кратного буфера из набора. Температурные условия: 96° (1 мин), затем 33 цикла (98° (10 с), 50° (5 с), 60° (4 мин)). Очистку от невклю-чившегося BigDye-реагента проводили осаждением в 60%-ном изопропаноле, разбавив реакцию водой до 30 или 40 мкл.
Выделение суммарной РНК. Органы взрослых лабораторных мышей линий BALB и C57B
получали в лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦиГ СО РАН. С помощью набора RNeasy Total RNA Kit («Qiagen») выделяли суммарную РНК согласно протоколу производителя.
ОТ-ПЦР. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 25 мкл с 2 мкг суммарной РНК с помощью M-MLV Reverse Transcriptase («Promega», США) с использованием RNAsin и праймера oligo(dT)15 согласно протоколу производителя. Полученную кДНК использовали как матрицу для ПЦР c AmpliTaq Gold DNA Polymerase («Applied Biosystems») согласно протоколу производителя. Температурные условия ПЦР: 94° (7 мин), затем 35-40 циклов (93° (30 с), 60° (30 с), 72° (35 с - 1 мин 35 с)), 72° (7 мин).
Для перекрестной ПЦР между экзонами (рис. 1) использовали общий смысловой прай-
мер ExA69F (5'-gtgacccttgtcctggagacgcag-3') в паре с антисмысловыми праймерами ExB/-132B (5'-gcttcgcttgctttcctcagtc-3'), Ex/B317B (5'-taat-acgctggaaacaggca-3'), ExC358B (5'-gctcataacgctgt-tagttgtttgtat-3'), ExD500B (5'-agggagttgagcagagcg-ta-3'), AGBPE1 (5'-gaaagattctgcaccatgtggc-3'), CBN (5'-ccctctccagagacctaatc-3'), 045 (5'-ggcgatg-gtttgctgaacac-3'), Ex/1-658B (5'-tgaaagccaccatgat-gctctctct-3'), Ex2-1078B (5'-aaagtgattattaactc-caccagg-3'), Ex3-1250B (5'-atgataactgcgggtccaaa-3'); Ex4-985B (5'-tacggaagacaatacctctcccga-3').
Для локализации старта транскрипции М23А
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.