МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 5, с. 749-759
ГЕНОМИКА. ^^^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.21
ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ КОНСЕРВАТИВНЫХ И ВАРИАБЕЛЬНЫХ РАЙОНОВ В ГЕНАХ 16S рРНК УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ACETOBACTERACEAE*
© 2015 г. S. Chakravorty, S. Sarkar, R. Gachhui*
Department of Life Science and Biotechnology, Jadavpur University, Kolkata-700032, West Bengal, India
Поступила в редакцию 20.08.2014 г.
Принята к печати 27.01.2015 г.
Бактерии семейства Acetobacteraceae, относящегося к классу альфапротеобактерий, проявляют толеран-тость к высоким концентрациям сахаров и кислот. Уксуснокислые бактерии, используемые в виноделии, производстве уксуса и ряда других продуктов, имеют наибольшую экономическую значимость. Acetobacteraceae в незначительных количествах находят в окружающей среде, а их культивирование в лабораторных условиях часто затруднено. Идентификация Acetobacteraceae в природе сильно зависит от применения современных молекулярно-биологических методов, требующих точного знания консервативных нуклеотидных последовательностей генов, которые могут использоваться в качестве праймеров и зондов. Более того, неконсервативные домены также могут служить маркерами при дифференциации близкородственных родов. У бактерий идеальным кандидатом на роль источника консервативных и вариабельных доменов считается ген 16S рРНК. С целью изучения консервативных и вариабельных доменов генов 16S рРНК уксуснокислых бактерий и представителей семейства Acetobacteraceae проведено выравнивание и сравнение нуклеотидных последовательностей, депонированных в общедоступных базах данных. Для подтверждения последовательностей доменов, полученных путем выравнивания, из биопленок чайного гриба, заселенных Acetobacteraceae, получены почти полные нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК. Показано, что степень консервативности этого гена у уксуснокислых бактерий значительно выше, чем в семействе Acetobacteraceae в целом. Установлено также, что описанные ранее гипервариабельные участки V1, V3, V5—V7 генов 16S рРНК более или менее консервативны в пределах всего семейства при различиях в протяженности вариабельных участков.
Ключевые слова: уксуснокислые бактерии, Acetobacteraceae, 16S рРНК, предсказание консервативных доменов, гипервариабельный район, Vienna RNA.
IDENTIFICATION OF NEW CONSERVED AND VARIABLE REGIONS IN THE 16S rRNA GENE OF ACETIC ACID BACTERIA AND ACETOBACTERACEAE FAMILY*, by S. Chakravorty, S. Sarkar, R. Gachhui* (Department of Life Science and Biotechnology, Jadavpur University, Kolkata-700032, West Bengal, India*E-mail: somnathsoft@gmail.com, sarkar.soumyadev@gmail.com, ratangachhui@yahoo.com). The Acetobacteraceae family of the class Alpha Proteobacteria is comprised of high sugar and acid tolerant bacteria. The Acetic Acid Bacteria are the economically most significant group of this family because of its association with food products like vinegar, wine etc. Acetobacteraceae are often hard to culture in laboratory conditions and they also maintain very low abundances in their natural habitats. Thus identification of the organisms in such environments is greatly dependent on modern tools of molecular biology which require a thorough knowledge of specific conserved gene sequences that may act as primers and or probes. Moreover unconserved domains in genes also become markers for differentiating closely related genera. In bacteria, the 16S rRNA gene is an ideal candidate for such conserved and variable domains. In order to study the conserved and variable domains of the 16S rRNA gene of Acetic Acid Bacteria and the Acetobacteraceae family, sequences from publicly available databases were aligned and compared. Near complete sequences of the gene were also obtained from Kombucha tea biofilm, a known Acetobacteraceae family habitat, in order to corroborate the domains obtained from the alignment studies. The study indicated that the degree of conservation in the gene is significantly higher among the Acetic Acid Bacteria than the whole Acetobacteraceae family. Moreover it was also observed that the previously described hypervariable regions V1, V3, V5, V6 and V7 were more or less conserved in the family and the spans of the variable regions are quite distinct as well.
Keywords: acetic acid bacteria, Acetobacteraceae, 16S rRNA, conserved domain prediction, hypervariable region, Vienna RNA package.
DOI: 10.7868/S0026898415050055
# Статья представлена на английском языке.
* Эл. почта: somnathsoft@gmail.com, sarkar.soumyadev@gmail.com, ratangachhui@yahoo.com
Семейство Acetobacteraceae — большая группа альфапротеобактерий, способных сбраживать сахара в кислоту и обитающих в условиях высокого содержания сахаров и низких значений рН [1]. Это семейство состоит из 35 родов — Acetobacter, Acidicaldus, Acidiphilium, Acidisoma, Acidisphaera, Acidocella, Acidomonas, Ameyamaea, Asaia, Belnapia, Craurococcus, Endobacter, Gluconacetobacter, Glu-conobacter, Granulibacter, Humitalea, Komagataei-bacter, Kozakia, Muricoccus, Neoasaia, Neokomaga-taea, Nguyenibacter, Oleomonas, Paracraurococcus, Rhodopila, Rhodovarius, Roseococcus, Roseomonas, Rubritepida, Saccharibacter, Stella, Swaminathania, Tanticharoenia, Teichococcus и Zavarzinia [2]. Уксуснокислые бактерии (AAB) образуют, по-видимому, наиболее распространенную группу этого семейства [3]. Эти бактерии играют важную роль в производстве пищевых продуктов с использованием уксуснокислого брожения, а также таких напитков, как кефир, чайный гриб, и в скисании вина [3—7]. Таксономия AAB еще недостаточно разработана и подвергается значительным изменениям. В настоящее время к ААВ относятся 13 родов — Acetobacter, Acidomonas, Ameyamaea, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter, Granulibacter, Koza-kia, Neoasaia, Nguyenibacter, Saccharibacter, Swaminathania и Tanticharoenia. Acidomonas, Ameyamaea, Granulibacter, Kozakia, Neoasaia, Saccharibacter, Swaminathania и Tanticharoenia довольно редко встречаются в пищевых продуктах, уксусе, вине, фруктах и цветах [7, 8]. К ААВ недавно добавили новый род — Komagataeibacter, появление которого связано, главным образом, с реклассификацией рода Gluconacetobacter [8]. Gluconacetobacter, Gluconobacter и Acetobacter г—бактерии группы AAB, наиболее пригодные для применения в микробиологическом производстве пищевых продуктов [3, 7]. В состав AAB и Acetobacteraceae входят несколько родов, способных к биологической фиксации азота (BNF), в том числе содержащих бактерио-хлорофилл а и каротиноиды, что повышает их экономическую значимость [1, 9, 10].
Показано, что среда обитания Acetobacteraceae расширяется в результате проникновения этих бактерий в различные ниши, граничащие, например, с участками, загрязненными тяжелыми металлами, с горячими источниками и другими местами с экстремальными условиями [11, 12]. Эти места заселяют и другие сходные бактерии [3, 6, 9], что делает идентификацию и получение чистых культур Acetobacteraceae еще более трудной задачей. Очень сложна и очистка AAB/Acetobacterace-ae [3]. Методы, основанные на культивировании, имеют существенный недостаток — они позволяют получить чистые культуры примерно из 1% разных бактериальных сообществ [13]. Хорошо известно, что в процессе культивирования бактерии могут утратить некоторые свойства, проявляемые в сложных сообществах, поэтому они, стро-
го говоря, относятся к некультивируемым [14]. Даже после получения чистой культуры идентификация вида может занять много времени, так как в ее основе лежит биохимический анализ, за которым следуют выделение хромосомной ДНК, амплификация и секвенирование генов 16S рРНК [4, 5]. Методы, не связанные с секвениро-ванием, такие как электрофорез в денатурирующем градиентном геле (DGGE) [15], анализ полиморфизма длины концевых фрагментов (T-RFLP) [16], флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) [17], катализируемое отложение репорте-ра-FISH (CARD-FISH) [18], также используются для мониторинга микробных популяций. Эти достаточно быстрые и эффективные методы основаны на анализе коротких фрагментов консервативного гена, что требует анализа большого числа последовательностей для дизайна прайме-ров, которые позволят идентифицировать специфические участки гена.
Современные методы секвенирования следующего поколения, или высокоэффективное се-квенирование (HTS) быстро становятся методами выбора для идентификации популяций бактерий из различных источников [19—21]. В методах HTS в качестве гена выбора используется ген 16S рРНК, содержащий набор консервативных и гипервариабельных районов [6, 22, 23]. Гипервариабельные участки этого гена хорошо изучены у большого числа бактерий. Всего выявлено девять таких участков — V1—V9, которые занимают положения 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986-1043, 1117-1173, 1243-1294 и 1435-1465 соответственно [24]. Следует иметь в виду, что нумерация этих участков соответствует нумерации гена 16S рРНК Escherichia coli. В методах HTS используется, в основном, вариабельность этих районов, но нумерация не должна опираться только на единственный консенсус, так как известно, что у бактерий разного рода гипервариабельные районы гена 16S рРНК могут попадать в консервативные домены. По этой причине метод не сможет различить представителей близкородственных родов в сложных сообществах. Консервативные и гипервариабельные участки генов 16S рРНК изучены у представителей разных родов бактерий [25-27], однако у AAB и Acetobacteraceae подобное исследование не проводили.
Нами изучена консервативность и вариабельность нуклеотидной последовательности и структуры гена 16S рРНК у представителей всех родов AAB и Acetobacteraceae. Проанализированы 152 последовательности, часть которых получена из биопленок чайного гриба без культивирования, а часть - из последовательностей, представленных в базе данных NCBI GenBank. Биопленки чайного гриба были выбраны, потому что это известный источник AAB и/или Acetobacteraceae. Ожидалось, что из биопленок можно
получить значительное число последовательностей гена 16S рРНК, принадлежащ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.