ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 2, с. 135-140
УДК 543.5:547.96:577.112
ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ МЕЖКЛЕТОЧНОГО ПРОСТРАНСТВА МЕТОДОМ MALDI-TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
© 2011 г. А. П. Ильина*, О. Г. Куликова*, Д. И. Мальцев*, М. С. Краснов**, Е. Ю. Рыбакова**, В. С. Скрипникова**, Е. С. Кузнецова***, А. К. Буряк***, В. П. Ямскова**, И. А. Ямсков*
*Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, 119991
e-mail: Yamskov@mail.ru **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 119334 e-mail: Yamskova-vp@yandex.ru ***Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, Москва, 119991
e-mail: AKBuryak@ipcjrssi.ru Поступила в редакцию 12.05.2010 г.
Методом матричной лазерной десорбционной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) проведен анализ пептидов, входящих в состав ранее не изученных биорегуляторов, выделенных из межклеточного пространства тканей различных органов млекопитающих, а также растений и грибов. В исследование были включены 15 различных тканей млекопитающих, 13 видов растений и 2 вида грибов. На примере исследования биорегуляторов, выделенных из разных тканей глаза, было показано, что в их состав входят пептидные компоненты с одинаковыми значениями молекулярных масс. В состав биорегуляторов, выделенных из тканей различных органов млекопитающих или разных видов растений и грибов входят пептиды с различными значениями молекулярных масс. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения об основной функции биорегуляторов данной группы — участии в регуляции ор-ганно-тканевого гомеостаза в биологических системах.
В различных тканях млекопитающих и растений была обнаружена новая, ранее не изученная группа биорегуляторов, которые в сверхмалых дозах (10-8— 10-15 мг белка/мл) оказывают влияние на миграцию и адгезию клеток, клеточную пролиферацию и диф-ференцировку. Показано, что свойство биорегуляторов данной группы стимулировать восстановление и репарацию в патологически измененных тканях связано с их способностью дополнительно активировать клеточные источники регенерации [1—10]. На основании своеобразия их свойств и активности данные биорегуляторы выделены в отдельную группу мембранотропных гомеостатиче-ских тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ).
Установлено, что МГТБ в сверхмалых дозах стимулируют восстановительные процессы в патологически измененных тканях, а их биологическая активность характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности. На основе МГТБ разработаны и применяются в медицине фармакологические препараты, например, Адгелон для лечения кератопатий различной этиологии, заболеваний суставов и переломов. Большие перспективы использования МГТБ обусловливают большой интерес к их поиску и выделению из различных биологических объектов (млекопитающие, растения, микроорганизмы и т.д.).
К настоящему времени установлено, что МГТБ имеют сложный состав: методом ЯМР было показа-
но присутствие в них не только белковой, но также углеводной и липидной компонент, однако остается не известной их функциональная значимость в составе МГТБ [6, 11—13]. Наиболее изучена белковая компонента МГТБ — пептиды (мол. масса 1—8 кДа), ответственные за их активность, а также белки-модуляторы, оказывающие влияние на биологическое действие пептидов и взаимодействующие с ними по Са+2-связывающему механизму [13, 14]. Кроме того, установлено, что МГТБ имеют внеклеточную локализацию, например, МГТБ, выделенный из печени крысы, локализован в ней в области синусоида, МГТБ, выделенный из сыворотки крови крупного рогатого скота, — в межгепатоцитарном пространстве; из сетчатки глаза быка — на поверхности отростков фоторецепторов, а МГТБ, выделенный из листьев подорожника большого, — в межклеточном пространстве ткани листа [8, 15—17]. Для выделения и очистки биорегуляторов данной группы был разработан оригинальный метод, включающий биохимические методики, метод биотестирования и методы физико-химического исследования белков [1, 18]. Применение этого методического подхода позволило получить небольшие количества очищенных пептидов, входящих в состав МГТБ, что определило применение методов масс-спектрометрии для их исследования. Высокая чувствительность МАЬЭ1-ТОБ масс-спектрометрии (10-4—10-8 М) позволяет обнаруживать минорные компоненты сложных
белковых смесей и устанавливать молекулярные массы этих белков на всех этапах исследовании.
Следует отметить, что основным этапом очистки МГТБ является отделение их от примесных белков при высаливании тканевого экстракта в насыщенном растворе сернокислого аммония. В этих условиях МГТБ остаются в растворенном состоянии, а остальные белки переходят в осадок. Поэтому фракции надосадочной жидкости (супернатанты), полученные после высаливания тканевых экстрактов, содержат, в основном, МГТБ, представленные комплексом, образованным биологически активными пептидами и модулятором, состоящим из белков с молекулярной массой от 15 до 66 кДа [14]. В связи с этим исследование состава пептидов на данной стадии представляется весьма актуальным, поскольку это дает возможность выявить наиболее полно пептидные компоненты, входящие в состав МГТБ.
В настоящем исследовании были идентифицированы пептиды, входящие в состав МГТБ, выделенных из различных источников: тканей млекопитающих, растений, а также грибов. Методом МЛЬЭ1-ТОР масс-спектрометрического анализа были проанализированы супернатанты 15 тканевых экстрактов животного происхождения, 18 — растительного и 2 видов грибов.
Цель работы — определение молекулярной массы пептидных компонентов, входящих в состав фракций супернатантов, содержащих МГТБ.
МЕТОДИКА
Биологический материал. Ткани глаза (склера, роговица, хрусталик, радужка, стекловидное тело, сетчатка, пигментный эпителий, цилиарное тело) получали из свежеэнуклеированных глаз молодых бычков Bos taurus Taurus L. возрастом до 1 года (всего 60 глаз), которые так же, как и печень (1.5 кг) бычков были предоставлены Таганским мясоперерабатывающим комбинатом г. Москвы. Печень, мозг, сердце и кость выделяли из крыс Вистар, обоего пола, массой 180-250 г, содержащихся в виварии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Использовали препарат "Сыворотка крови крупного рогатого скота, стерильная, инактивированная, питательная добавка при культивировании клеток и тканей", произведенный в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, и эмбриональную телячью сыворотку фирмы "Serva" (Германия).
Растительное сырье (лук Allium cepa L., чеснок Allium sativum L., алоэ Aloe arborescens L., чистотел Che-lidonium L., свекла Beta vulgaris L., арбуз Citrullus lana-tus Thunb., дыня Cucumis melo L., тыква Cucurbita pepo L., хрен Armoracia rusticana Gilib., лимон Citrus limon L., подорожник Plantago major L., полыньArtemi-sia absinthium L. и одуванчик Taraxacum officinale
Wigg.) было получено из Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН, грибы (лисичка Cantharel-lus cibarius Fr. и трутовик Fomes fomentarius L.) были собраны в экологически чистом регионе Владимирской области.
Выделение биорегуляторов. Ткани млекопитающих, в том числе глаза быка, отделяли друг от друга микрохирургическим способом, и так же, как и ткани растений и грибов, разрезали на фрагменты размером 1—1.5 см и экстрагировали 2 ч при 4°С в водно-солевом растворе (0.15 M NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ Hepes). После центрифугирования тканевого экстракта (3000 g, 30 мин) надосадочную жидкость собирали и высаливали сухим сернокислым аммонием до получения насыщенного раствора соли (780 г/л) в присутствии 10-2 М ЭДТА, и оставляли на 80—90 ч при 4°С. Полученный солевой раствор смеси белков центрифугировали (10500 g, 45 мин). После этого супернатант отделяли от осадка и длительно диализовали против воды до полного удаления соли. Полученные бессолевые супернатанты экстрактов концентрировали, используя вакуумный роторный испаритель при 40°С, определяли в них количественное содержание белка по методу Варбурга и Кристиана [19], мембранотропную активность адге-зиометрическим методом [2] и исследовали MALDI-TOF масс-спектрометрическим методом.
Масс-спектрометрический анализ. Масс-спек-трометрический анализ осуществляли с помощью времяпролетного MALDI-TOF масс-спектрометра UltraFlex 2 ("Bruker Daltonics", Германия), оснащенного азотным лазером 337 нм при частоте импульса до 20 Гц. Все измерения проводили в линейном режиме, детектируя положительные ионы. Для накопления масс-спектров мощность лазерного излучения устанавливали на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции— ионизации образца. Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z от 1000 до 20000. Внешнюю калибровку проводили с использованием точных значений масс известных белков. Образец наносили на три ячейки планшета, для каждой из которых записывали спектр, полученный в результате суммирования 10 серий спектров по 50 импульсов лазера для каждой. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы "Bruker Daltonics" (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11). Точность измерения масс составляла ±2 Да. В качестве матрицы применяли а-циано-4-гидроксико-ричную кислоту "Sigma-Aldrich" (Германия) в виде насыщенного раствора в смеси 50%-ного ацетонит-рила и 2.5%-ной трифторуксусной кислоты. Все использованные реактивы, включая воду, были аналитической чистоты или специальные для масс-спек-трометрии.
Таблица 1. Сигналы масс-спектров пептидов, идентифицированных в супернатантах тканевых экстрактов крысы и быка
Источник М, m/z Концентрация белка, мг/мл
Склера глаза Bos taurus Taurus L. 4171, 4302, 4531, 4819 0.039
Роговица глаза Bos taurus taurus L. 1442, 3376, 3973, 4302, 4418, 4531, 4817, 8604 0.0105
Хрусталик глаза Bos taurus taurus L. 4302, 4529, 4817, 8604 0.0041
Радужка глаза Bos taurus taurus L. 3944, 4301 0.083
Цилиарное тело глаза Bos taurus taurus L. 4301 0.068
Стекловидное тело глаза Bos taurus taurus L. 4300, 4370, 4420 0.081
Сетчатка глаза Bos taurus taurus L. 4302,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.