ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 460, № 3, с. 356-358
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.816:577.175.822
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОДТИПОВ М-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В АУТОРЕГУЛЯЦИИ ОСВОБОЖДЕНИЯ КВАНТОВ МЕДИАТОРА ИЗ ДВИГАТЕЛЬНЫХ НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЙ © 2015 г. И. В. Ковязина, А. Н. Ценцевицкий, академик РАН Е. Е. Никольский
Поступило 30.07.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565215030287
В предыдущих исследованиях нами было показано, что изменение амплитуды последовательных потенциалов (токов) концевой пластинки в ходе высокочастотной стимуляции двигательного нерва связано не только с изменением величины квантового состава синаптических ответов, но и с нарушением синхронности секреции ацетилхо-лина (АХ) в отдельных активных зонах [1]. Так как высокочастотная активность создает условия для аккумуляции в синаптической щели эндогенного АХ, была высказана гипотеза, что описанные изменения выделения медиатора могут быть обусловлены активацией пресинаптических хо-линорецепторов. В пользу справедливости этой гипотезы свидетельствуют полученные ранее данные о том, что экзогенный АХ или его аналоги вызывают снижение квантового состава токов концевой пластинки (ТКП) и десинхронизацию выделения отдельных квантов, формирующих многоквантовый ответ [2, 3].
Известно, что в двигательном нервном окончании присутствуют холинорецепторы Н- и М-подтипов [2, 4]. Целью настоящего исследования было выяснение роли разных подтипов му-скариновых холинорецепторов в ауторегуляции процесса освобождения медиатора при ритмической стимуляции нерва с низкой (0.5 имп/с) и высокой (100 имп/с) частотой при близком к физиологическому уровню содержания ионов кальция в среде.
Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах m. sartorius лягушек Rana ridibunda. Изолированную мышцу с фрагментом нерва помещали в экспериментальную камеру объемом 3 мл, через которую протекал раствор Рингера (pH 7.3—7.4) следующего со-
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук Казанский (Приволжский) федеральный университет Казанский государственный медицинский университет
става (ммоль/л): NaCl - 113.0, KCl - 2.5, NaHCO3 -3.0, CaCl2 — 1.8. Токи концевой пластинки (ТКП) регистрировали с использованием метода двух-электродной фиксации мембранного потенциала. Мембранный потенциал мышечного волокна в области синапса фиксировали на уровне —60 мВ. Регистрирующий комплекс включал в себя быстродействующий аналого-цифровой преобразователь и компьютерную станцию, что позволяло с высокой точностью измерять синаптические сигналы и анализировать их амплитудно-временные параметры. В каждом мышечном волокне регистрировали 100—200 вызванных и миниатюрных ТКП (мТКП).
Величину квантового состава ТКП оценивали как соотношение усредненных амплитуд вызванных многоквантовых ответов и мТКП [5]. О степени синхронности процесса секреции судили по соотношению длительностей переднего фронта (20—80% амплитуды) многоквантовых и одно-квантовых ТКП [6].
Для блокады мускариновых рецепторов подтипа М1 использовали пирензепин (100 нмоль/л) и новый [7] селективный блокатор VU0255035 (100 нмоль/л). Для блокады М2/М4-холинорецеп-торов использовали метоктрамин (10 нмоль/л), М3-холинорецепторов — селективный антагонист 4-DAMP (1 мкмоль/л).
В контрольных экспериментах были зарегистрированы спонтанные и вызванные стимуляцией двигательного нерва постсинаптические ответы со следующими характеристиками: амплитуда ТКП — 383.2 ± 39.4 нА, амплитуда мТКП — 2.8 ± 0.14 нА; время роста ТКП — от 20 до 80% (348.0 ± 17.5 мкс), время роста мТКП — от 20 до 80% (227.7 ± 14.0 мкс), постоянная времени спада ТКП и мТКП составили соответственно 1.2 ± ± 0.06 и 1.1 ± 0.07 мс (n = 26).
В ходе высокочастотной стимуляции (пачка 60 импульсов с частотой 100 имп/с) мы наблюдали изменения амплитуды и времени роста ТКП, которые были выражены в разной степени в кон-
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОДТИПОВ М-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ
357
0
10 20 30 40 50 60
0
60 }
10 20 30 40 50 60
Рис. 1. Относительное изменение времени роста ТКП (М ± т) в ходе ВПИ (100 имп./с) в контроле (светлые кружки) и в присутствии антагонистов М-холинорецепторов (темные треугольники). За 100% принято время роста первого ТКП в ВПИ. (а) — пирензепин (100 нмоль/л), (б) — Уи0255035 (100 нмоль/л), (в) — метоктрамин (10 нмоль/л), (г) — 4-БАМР (1 мкмоль/л).
троле и в присутствии мускаринолитиков. Стимуляция двигательного нерва с частотой 100 имп./с в интактных препаратах приводила к небольшому увеличению амплитуд в начале пачки (на 15.0 ± ± 3.8% для 4-го ТКП) и затем к последующему их снижению (на 21.3 ± 3.7% к 60-му ТКП в пачке) и небольшому (на 13.5 ± 1.6%, п = 27, рис. 1), но статистически значимому увеличению длительности переднего фронта сигналов. Поскольку амплитудно-временные параметры мТКП, зарегистрированные до и сразу после окончания пачки импульсов, достоверно не различались, то увеличение длительности переднего фронта ТКП свидетельствует об изменении степени синхронности процесса секреции отдельных квантов медиатора при высокочастотной стимуляции нерва.
Блокатор М1-холинорецепторов пирензепин не вызывал изменения амплитудно-временных характеристик мТКП и ТКП и квантового состава ТКП) при низкочастотной стимуляции нерва (0.5 имп./с). Однако при раздражении нерва с высокой частотой мы наблюдали большее снижение амплитуд ТКП в ходе пачки (на 12% по сравнению с контролем). Увеличение длительности фазы роста ТКП в ходе высокочастотной пачки импульсов (ВПИ) в присутствии пирензепина было менее выраженным, чем в интактном препарате (на 9.9 ± 1.8% для 60-го ТКП в пачке, рис. 1а), что можно расценивать как незначительную десин-хронизацию секреторного процесса.
Качественно аналогичный, но более значимый в количественном отношении эффект наблюдали при использовании другого М1-антаго-ниста — УШ255035. При высокочастотной стимуляции, как и в случае с пирензепином, мы наблюдали более выраженную по сравнению с контролем синаптическую депрессию: падение амплитуд ТКП к 60-му сигналу составило 46 ± 3.1% по сравнению с 21.3 ± 3.7% в контроле. Время роста ТКП в ходе пачки импульсов изменялось в гораздо меньшей степени по сравнению с этим показателем в интактном препарате (на 3.8 ± 1.1% по сравнению с 13.0 ± 2.5% в контроле, 60-й ТКП, рис. 1б). Кроме того, Уи0255035 снижал квантовый состав ТКП даже при низкочастотной стимуляции нерва (до 78.3 ± 4.1%,р < 0.001, п = 7).
Таким образом, эффективность Уи0255035 была выше по сравнению с пирензепином, что может быть связано с более высокой селективностью данного соединения. Следует отметить, что Уи0255035, по-видимому, обладает и легким ку-рареподобным действием — в его присутствии наблюдали небольшое, но достоверное уменьшение амплитуд мТКП (на 6%,р < 0.005).
Аппликация антагониста мускариновых М2/М4-холинорецепторов метоктрамина не влияла на амплитудно-временные параметры ТКП и мТКП при редкой частоте раздражения двигательного нерва. При высокочастотной стимуляции в присутствии метоктрамина наблюдали более выраженную фа-силитацию освобождения медиатора в начале
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 460 № 3 2015
358
КОВЯЗИНА и др.
ВПИ (на 37.0 ± 4.5% для 4-го сигнала по сравнению с 16.1 ± 4.3% в контроле), что подтверждается данными литературы о том, что активация М2-холино-рецепторов приводит к угнетению квантового освобождения медиатора [8]. Увеличение длительности переднего фронта ТКП в ходе ВПИ было таким же, как и в интактных препаратах (рис. 1в), т.е. блокада М2/М4-холинорецепторов не сказывалась на способности эндогенного АХ десинхронизировать секреторный процесс.
Антагонист мускариновых рецепторов подтипа М3 — 4-ЭАМР также не влиял на амплитудно-временные параметры ТКП и мТКП при редкой частоте раздражения. В ходе ВПИ аппликация 4-ЭАМР вызывала более выраженную синапти-ческую депрессию (до 54.1 ± 2.0% к 60-му сигналу ВПИ). Однако увеличение длительности переднего фронта ТКП в ходе ВПИ было таким же, как и в интактных препаратах (рис. 1г).
Таким образом, проведенные эксперименты дают основания предполагать, что при близком к физиологическому уровню ионов кальция в среде процесс секреции медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки модулируется при участии всех исследованных подтипов мускариновых хо-линорецепторов — М1, М2/М4 и М3. Поскольку использованные мускариновые антагонисты не позволяли избирательно блокировать М2- либо М4-холинорецепторы, на основании данного исследования мы не можем сделать окончательный вывод о том, какой именно подтип ответственен за регуляцию амплитуд ТКП при ритмической стимуляции.
При низкой частоте стимуляции, когда концентрация эндогенного АХ в синаптической щели невысока, очевидна роль только М1-холино-рецепторов, которая состоит в увеличении интенсивности секреции (квантового состава ТКП). При высокочастотной стимуляции нерва, способствующей аккумуляции в околосинаптическом пространстве эндогенного медиатора, ауторегуля-ция проявляется более ярко. Так, в этих условиях активация М1-холинорецепторов, наряду с изменением квантового состава, приводит еще и к увеличению длительности переднего фронта ТКП, что можно расценивать как свидетельство десинхрони-зации секреторного процесса. Кроме того, при высокочастотной активности в процесс ауторегуля-
ции включаются и М-холинорецепторы других подтипов. Однако их роль сводится к модуляции интенсивности секреции — активация М2/М4-холинорецепторов угнетает квантовый выброс, а МЗ-холинорецепторов, наоборот, усиливает.
Традиционно фасилитацию секреции АХ, опосредуемую через активацию М1-холинорецепто-ров, связывают с активацией фосфолипазы C, ведущей к синтезу инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3) и диацилглицерина (DAG) [9]. IP3 повышает интенсивность секреции путем освобождения ионов кальция из внутриклеточных депо, в то время как DAG (короткоживущее соединение) может оказывать прямое влияние на белки аппарата экзоцитоза. Ответ на вопрос, какой из этих механизмов мог бы приводить к изменению кинетики (степени синхронности) секреторного процесса, и имеет ли это физиологический смысл, требует дальнейшего исследования.
Работа выполнена
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.