научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНО ИНВАЗИВНЫХ ВИДОВ ЧЕРНЫХ МОШЕК [DIPTERA: SIMULIIDAE] АРМЕНИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ИЗМЕНЧИВОСТИ ШТРИХКОДОВОГО ГЕНА МТДНК COX1 И ХРОМОСОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА Биология

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНО ИНВАЗИВНЫХ ВИДОВ ЧЕРНЫХ МОШЕК [DIPTERA: SIMULIIDAE] АРМЕНИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ИЗМЕНЧИВОСТИ ШТРИХКОДОВОГО ГЕНА МТДНК COX1 И ХРОМОСОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА»

ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 3, с. 351-361

ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ

УДК 575.21:595.2:59.018

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНО ИНВАЗИВНЫХ ВИДОВ ЧЕРНЫХ МОШЕК [Díptera: Simuliidae] АРМЕНИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ИЗМЕНЧИВОСТИ ШТРИХКОДОВОГО ГЕНА мтДНК coxl И ХРОМОСОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА

© 2015 г. Б. В. Андрианов1, И. И. Горячева1, С. В. Власов2, Т. В. Горелова1, М. В. Арутюнова3,

К. В. Арутюнова3, К. Р. Маилян3, И. А. Захаров1

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 e-mail: andrianovb@mail.ru; iigoryacheva@mail.ru 2Московский государственный областной университет, кафедра биологии и экологии животных, Москва 105005 3Институт молекулярной биологии Национальной академии наук Республики Армения, Ереван 0014

Поступила в редакцию 11.08.2014 г.

Черные мошки (Díptera, Simuliidae) хорошо известны благодаря их медицинскому, экологическому и ветеринарному значению. Фауна мошек Армении включает 53 вида. Ряд массовых видов имеют важное экологическое значение. Для характеристики видового статуса мошек, обитающих на территории Армении, был проведен комплексный анализ с использованием морфометрических, цито-генетических и молекулярно-генетических методов. Показано, что наиболее массовые виды мошек Simulium paraequinum и Simulium kiritshenkoi относятся к группе видов мошек с минимальной изменчивостью по гену cox1. Недавно обнаруженные, новые для Армении виды Simulium noellery и Simulium [B.] erythrocephalum можно рассматривать как потенциально инвазивные, что подтверждается низким уровнем изменчивости гена cox1.

DOI: 10.7868/S0016675815020034

Глобальные изменения климата и антропогенное влияние закономерно становятся причиной как локального вымирания многих видов насекомых, так и вспышек численности и быстрого расширения ареалов других видов насекомых. Феномен появления так называемых инвазивных видов насекомых, формирующих популяции с быстро расширяющимся ареалом и достигающих высокой плотности, стал объектом многих попу-ляционно-генетических исследований. К числу наиболее известных инвазивных видов насекомых относятся колорадский жук Leptinotarsa de-cemlineata (Say, 1824), каштановая минирующая моль Cameraria ohridella (Deschka and Dimic, 1986)

[1], термиты Coptotermes formosanus (Shiraki, 1909)

[2], божья коровка Harmonia axyridis (Pallas, 1846)

[3]. Изучены генетические отличия инвазивных популяций этих видов от неинвазивных. Наиболее подробно феномен инвазивности был изучен у жуков на примере H. axyridis. На молекулярно-гентическом уровне характеристика инвазивных популяций видов проводится на основании данных о структуре фрагмента гена coxl, изменчивости микросателлитных маркеров, наличии бактериальных внутриклеточных симбионтов. Полученные по перечисленным показателям данные показывают сниженный уровень изменчивости в инвазивных популяциях по сравнению с неинва-

зивными. Вместе с тем проблема генетической идентификации инвазивного статуса популяции далека от решения [4, 5]. Особенно значимы исследования инвазивных популяций видов насекомых — переносчиков трансмиссивных заболеваний человека, так как вспышки их численности могут привести к появлению новых очагов. Кровососущие виды мошек способны вызывать си-мулиотоксикоз, а также служат специфическими переносчиками онхоцеркоза человека и сельскохозяйственных животных [6]. Причины формирования инвазивных популяций насекомых остаются во многом неизвестными. Мы проанализировали фауну черных мошек Армении, включающую как аборигенные, так и инвазивные виды, с целью выявления генетических особенностей, характеризующих инвазивные виды.

Ранее фауна черных мошек Армении в основном изучалась только методами классической систематики на основе морфометрии имаго и личинок с привлечением данных цитогенетического анализа политенных хромосом слюнных желез личинок четвертого возраста. В результате проведенных исследований было показано, что фауна черных мошек представлена 53 видами, относящимися к 5 родам [7, 8]. Отмечено проникновение в регион новых видов: 8. повИвп [9] и 8. вгуА-гоевркаШт [8, 10]. Последний вид заслуживает

особого внимания, так как способен давать вспышки численности [11].

Для идентификации видов кровососущих мошек мы применили сочетание методов классической систематики, цитогенетическое изучение хромосомного полиморфизма и метод ДНК-штрихкодирования. Такой подход ранее не применялся для характеристики фауны мошек Армении, что делало невозможным точную видовую идентификацию мошек на основании результатов ДНК анализа без привлечения данных морфологической систематики. Наиболее распространенные виды Simulium обычно представлены несколькими формами с различными митохон-дриальными гаплотипами [12, 13]. Внутривидовая нуклеотидная изменчиврсть гена cox1 у мошек рода Simulium, как правило, не превышает 4% [14], что позволяет делать выводы о видовой принадлежности собранных экземпляров по результатам ДНК-штрихкодирования.

Задача настоящей работы состояла в изучении возможности применения цитогенетических и молекулярно-генетических маркеров для идентификации видов мошек Армении и определения инвазивного статуса популяций.

В работе впервые изучен видовой состав фауны мошек Армении методами молекулярно-гене-тического анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сборы мошек. Материалом для исследований послужили личинки мошек, собранные на территории Армении. В работе проанализированы данные 139 сборов, сделанных с июля 2009 г. по май 2012 г. на территории 10 областей (марз) Армении: Ширакский, Лори, Тавушский, Арагацотнский, Армавирский, Котайский, Гегаркуникский, Араратский, Вайоц Дзорский и Сюникский (рис. 1). Просмотрено и установлена видовая принадлежность для 40 872 экземпляров личинок мошек. В работе принята система семейства, предложенная Сго88кеу [15, 16]. Вся видовая систематика приведена в соответствии с последней ревизией группы черных мошек [17]. Определение видов мошек проводили по морфологическим признакам [18— 23] и подтверждали цитогенетически.

Цитогенетический анализ. Цитогенетические препараты готовили по стандартной ацетоорсеи-новой методике. Личинки при сборах были зафиксированы в жидкости Карнуа. Для проведения сравнительного анализа морфологические препараты из личинок старших возрастов готовились одновременно с давлеными препаратами по-литенных хромосом слюнных желез из одних и тех же образцов мошек. Цитогенетический анализ вели по картам политенных хромосом мошек [24].

Выделение ДНК. ДНК из образцов выделялась стандартным фенол-хлороформным методом. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies, США). В реакцию ПЦР брали по 10 нг тотальной ДНК.

Условия проведения ПЦР. Амплификацию фрагментов ДНК проводили в объеме 25 мкл с использованием набора реактивов Encyclo PCR kit (Евроген, Россия). Реакционную смесь готовили в соответствии с рекомендациями производителя.

ПЦР-фрагмент митохондриального гена cox1 для проведения ДНК-штрихкодирования получали с помощью стандартных фолмеровских праймеров. Праймеры LC01490 (5'-GGTCAA-CAAATCATAAAGATATTGG-3') и HC02198 (5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3') ам-плифицируют специфический фрагмент 5'-обла-сти митохондриального гена cox1 длиной 658 пн у ряда групп беспозвоночных [25].

Первичная денатурация — 5 мин при 94°С; 5 циклов: денатурация при 94°С — 20 с, отжиг при 45°С — 20 с, синтез при 72°С — 40 с; затем еще 35 циклов: денатурация при 94°С — 20 с, отжиг при 55°С — 20 с, синтез при 72°С — 40 с; и завершающий синтез при 72°С — 7 мин. Очистку фракционированных в 1%-ном агарозном геле ПЦР-фраг-ментов проводили с использованием набора для элюции JETQUIK Gel Extraction Spin Kit (Genom-ed, Германия) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Очищенный ПЦР-про-дукт хранили при температуре —18°C.

Секвенирование продуктов амплификации проводили по методу Сэнгера с обоих праймеров с использованием ДНК-секвенатора ABI PRISM™ 377 и набора реактивов dGTP Big Dye Termination Kit (PE Applied Biosystems, США).

Биоинформационный анализ. В настоящее время нуклеотидная последовательность полного митохондриального генома ни для одного из видов мошек рода Simulium не получена, поэтому для аннотирования полученной последовательности мы воспользовались митохондриальным геномом Drosophilayakuba (Burla, 1954). В полном митохондриальном геноме D. yakuba (GenBank ID: NC_001322.1) этот фрагмент соответствует области с 1519 по 2174 нуклеотид.

Анализ хроматограмм проводили с помощью программы Cromas Pro 13.3. Выравнивание нук-леотидных последовательностей, полученных нами в результате секвенирования, с последовательностями, размещенными в базах данных, проводили с помощью ресурсов, расположенных на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Статистическую обработку последовательностей проводили с использованием программы BioEdit 7.0.5.3. Для построения дендрограмм использовалась программа MEGA5.0 [26] c алгоритмом Neighbor Joining. Для оценки статистической достоверно-

Рис. 1. Точки сбора личинок мошек в 2010—2013 гг. на территории Армении.

сти полученных деревьев была выбрана величина бутстрэп-поддержки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ 139 выборок мошек, как из антропогенных, так и природных местообитаний на территории Армении (см. раздел Материалы и методы), выявил 33 вида черных мошек (табл. 1). Для установления видов мошек с большей и меньшей численностью было проведено вычисление доли каждого вида в суммарной выборке мошек (табл. 1). Сравнение долей разных видов позволило выделить группы массовых и редких видов мошек. Десять наиболее многочисленных видов мошек в сумме составили 97% всей выборки, причем более

половины объема выборки образовано только двумя видами: S.paraequinum (Puri, 1933) и S. kiritshen-koi (Rubtsov, 1940). Эти виды не только самые многочисленные, но и самые широко распространенные в разных местообитаниях, о чем можно судить по числу точек сборов, в которых данные виды были обнаружены (табл. 1).

Для характеристики межвидовой и внутривидовой изменчивости мошек, прежде всего массовых видов и видов, потенциально способных стать инвазивными в силу особенностей своей экологии и

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком