БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 4, с. 629-638
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 577.3
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОСТОЯНИЙ В П РОЦЕССЕ ДИФФУЗИОННОГО СБЛИЖЕНИЯ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ ПЛАСТОЦИАНИНА И ЦИТОХРОМА f
© 2015 г. С.С. Хрущев, А.М. Абатурова, В.А. Федоров, И .Б. Коваленко,
Г.Ю. Ризниченко, А.Б. Рубин
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Ленинские горы E-mail: styx@biophys.msu.ru Поступила в p едакцию 29.05.15 г.
C использованием метода броуновской динамики проведено качественное исследование взаимодействия последовательности событий, предшествующих формированию функционально активного комплекса белков пластоцианина и цитохрома f. C помощью иерархического кластерного анализа идентифицированы промежуточные состояния этого процесса. П редложен сценарий сближения этих белков, в котором ключевую роль играет диффузионный захват молекулы пластоцианина. Охарактеризована подвижность пластоцианина при разных значениях энергии электростатического взаимодействия между молекулами.
Ключевые слова: взаимодействие белков, броуновская динамика, кластерный анализ, диффузионный зах ват.
Короткоживущие (transient) белок-белковые комплексы играют важную роль в различных процессах, протекающих в живой клетке. Формирование короткоживущих комплексов про -исходит при активации и ингибировании ферментативной активности, в процессе рецепции и передачи информации, при окислительно-восстановительных реакциях и др. В данной работе на основе вычислительного эксперимента про -изводится реконструкция процесса сближения двух молекул белков и проводится идентификация промежуточных состояний комплекса.
Пластоцианин и цитохром f являются классическими модельными объектами для исследования процесса формирования короткоживу-щих белок-белковых комплексов. Физиологическая функция пластоцианина состоит в челночном переносе электрона между цитохром-ным bf-комплексом и фотосистемой I. Передача электрона между реакционными центрами является достаточно быстрым процессом, поэтому общая скорость процесса в значительной мер е определяется способностью окислительно-восстановительных реакционных партнеров быстро сформировать функционально активный
Сокращения: СБ - центральное расстояние, КМ8Б -среднеквадратичное отклонение положений атомов, КБ -расстояние доступности.
комплекс (т.е. такую конфигурацию молекул, в которой происходит перенос электрона) в одном редокс-состоянии и способностью быстро диссоциировать после прохождения реакции [1].
Взаимодействие белков пластоцианина и цитохр ома / высших растений было исследовано методом броуновской динамики в работах [2-4]. Методом многочастичной броуновской динамики было исследовано взаимодействие этих белков в растворе [5] и люмене тилакоида [6], в том числе с учетом электростатических взаимодействий с тилакоидной мембраной [7]. В работе [8] дана количественная оценка вклада электростатических взаимодействий белков в их взаимную ориентацию при контакте. В р а -боте [9] предполагается, что существенную роль в формировании функционально активного комплекса белков пластоцианина и цитохр ома / играет происходящий при сближении макромолекул «диффузионный захват» [10], т.е. формирование такого состояния, при котором электростатические взаимодействия способствуют удержанию белковых молекул в тесном контакте, но в то же время не препятствуют их вращательному движению относительно друг друга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. Пластоцианин является мобильным перено счиком электронов, передающим электрон с цитохромного bf-ком-плекса на фотосистему I у всех высших ра стений и некоторых водорослей. Цитохром f - самая крупная субъединица цитохромного bf-ком-плекса, содержащая сайт связывания пласто-цианина. Окислительно-восстановительная активность пластоцианина обеспечивается наличием в его составе атома меди, меняющего степень окисления между +2 и +1. Цитохром f содер жит гем с атомом железа, меняющим степень окисления между +2 и +3. Комплекс пла-стоцианина с цитохромом f находится в быстром равновесии с несвязанными формами белков, для взаимодействия окисленного пласто-цианина из шпината Spinacia oleracea и восстановленного цитохр ома f из турнепса Brassica rapa константа ассоциации комплекса Ka = 7-103 М-1, константа скорости образования комплекса ka = 2108 М-1с-1 [11].
В настоящей модели используется стр уктура комплекса пластоциана шпината и цитохрома f турнепса (PDB ID: 2PCF) [1], полученная методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Рассматривалось взаимодействие восстановленного цитохрома f и окисленного пластоцианина. Распределение электростатических зарядов на атомах белков соответствует силовому полю CHARMM27 [12,13], на геме — взято из работы [14]. Заряды на атоме меди пластоцианина и связанных с ним аминокислотных остатках аппроксимированы на основе данных работы [15]. Суммар ные зар яды белков в модели составляли -8 (пластоцианин) и -4 (цитохром f) элементарного заряда. Структур а нативного bf-комплекса высших растений в настоящее время неизвестна, поэтому для сравнения использовали выравнивание растворимой части цитохрома f с полной структурой bf-комплекса зеленой водоросли Chlamydomo-nas reinhardtii (PDB ID: 1Q90).
Моделирование взаимодействия белков методом броуновской динамики. Метод броуновской динамики является одним из самых про -стых и в то же время эффективных методов исследования динамики твердых частиц в непрерывной вязкой среде [16,17]. В основе этого метода лежит представление о термодинамическом равновесии между частицей и средой. В результате взаимодействия со ср едой часть энергии хаотического теплового движения молекул среды передается частице, и та совершает хаотические блуждания. Исследование количественных закономерностей броуновского дви-
жения стало важной вехой в p азвитии теории случайных процессов [18,19]. Метод броуновской динамики как инструмент молекулярного моделирования нашел широкое применение в биологических исследованиях благодаря работам [20-22]. Развитие метода связано с р аботами [23,24] (обобщение для цепочки из гидродинамически взаимодействующих сфер) и работами [5,25] (многочастичные методы, в которых р ас-сматривается конкурентное взаимодействие множества белков с учетом интерьер а клеточного компартмента). В настоящее время метод броуновской динамики широко применяется для моделир ования самых р азных объектов, от отдельных ионов до массивных звезд [26]. Подробный обзор метода броуновской динамики применительно к моделированию взаимодействия белков приводится в работе [9].
Для моделир ования движения белков мы использовали программное обеспечение ProK-Sim (Protein Кшейс8 Simulator) [8]. Расчет движения макромолекул проводили с помощью уравнения Ланжевена:
mr = - ^r + F(r) + f(t),
где m - масса частицы, r - ее положение, t -время, - коэффициент вязкого трения, F(r) -внешняя сила, а F(t) - стохастический член (случайная сила). П р и исследовании диффузии белков мы пренебрегаем быстрой динамикой системы и используем шаг модели по времени At, равный 10-10 с, что значительно превышает время релаксации m/£, (10-12 с) и позволяет пренебречь инерциальным членом (среднее значение (mr)At ~ 0) и перейти к уравнению [24]:
^r = F(r) + f(t).
Смещение частицы Ax вдоль координатной оси x:
Ax = ■
F, At
Iх bti
V
2kTAt
N (0, 1),
где Fx - проекция внешней силы на соответствующую ось, ^ - коэффициент вязкого тр е-ния для движения вдоль оси, k - постоянная Больцмана, T - температура, N(0, 1) - нормально распределенная случайная величина с нулевым средним и единичной дисперсией [24]. Аналогичным образом для вращательных степеней свободы:
Aa = x £
M A
V
2kTAt
N(0, 1).
'rot
'rot
+
+
где Дах, Мх и - угол поворота, момент внешней силы и коэффициент вязкого трения для вращения относительно оси, вокруг которой рассматривается вращение, соответственно. Расчет коэффициентов вязкого трения для молекул белка проводили, как описано в работе [8]. Вязкость ср еды принимали равной 10-3 кгм-1с-1, что соответствует вязкости воды при 300 К.
В качестве источника внешней силы рассматривали электростатическое взаимодействие белков с учетом ионной силы раствор а. П ри подготовке модели производили расчет электростатического потенциала вокруг каждой из макромолекул с использованием линеаризованного уравнения Пуассона-Больцмана:
e0V[e(r)V9(r)] = -р + £
kT Lc¡ ziqP
где £0 - электрическая постоянная, е(г) - диэлектрическая проницаемость ср еды, ф(г) - электростатический потенциал, р - объемная плотность фиксированных электрических зарядов в молекуле белка, е°°- концентрация ионов в отсутствие электростатического поля, - заряд иона, др - заряд протона, обозначает суммирование по всем типам мобильных зарядов (ионов) в раствор е. Решение находилось на равномерной кубической сетке с шагом 0,1 нм по итерационной фор муле [27]:
4о + £ h&ft
Фо =
Й2К2 + £ hEoEj
где Ф0, фу - электростатический потенциал в ячейке, ^0 - суммар ный электр ический заряд в ячейке (без учета мобильных ионов электролитов), - диэлектрическая проницаемость ср еды
в ячейке, п - размер ячейки, к^ = \ —-
К!
обратная дебаевская длина для ионной оболоч-
1
ки
, NA - число Авогадро, I = -2£CTZ2 - ионная
сила раствора, обозначает суммирование по ячейкам, контактирующим с данной ячейкой одной гранью. Электростатический потенциал в ячейках, удаленных от любого атома белка более чем на 3,5 нм, принимали равным нулю. Диэлектрическую проницаемость растворителя принимали равной 80, белка - 2. Ионная сила раствора - 100 мМ, температура - 300 K.
Моделирование движения белков проводили в виртуальной кубической ячейке размером 30 х 30 х 30 нм3, граничные условия - пер ио-дические (тороидальные), т.е. при достижении границы ячейки молекула проходит через нее, появляясь с противоположной стороны ячейки. В каждом вычислительном эксперименте по одной молекуле белков пластоцианина и цито-хрома f помещали в ячейку в случайных положениях и ориентациях и проводили моделирование их движения до тех пор, пока энергия электростатичес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.