БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 3, с. 244-250
УДК 576.54
ИДЕНТИФИКАЦИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ В СВЕРХМАЛЫХ ДОЗАХ, И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
© 2007 г. А. В. Борисенко, В. П. Ямскова, И. В. Благодатских*, Б. Б. Березин*,
М. А. Крашхина*, И. А. Ямсков*
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 117334 Москва, ул. Вавилова, 26; факс: (495) 135-80-12; электронная почта: borisenko-av7@yandex.ru * Институт элементоорганических соединений им. А Н. Несмеянова РАН, 117813 Москва, ул. Вавилова, 28; факс: (495)135 5085; электронная почта: yamskova-vp@yandex.ru Поступила в редакцию 31.10.2006 г.
После доработки 19.01.2007 г.
Регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах, идентифицированы в тканях печени, легкого, почек, тонкого кишечника, а также в желчи млекопитающих. Кислые регуляторные белки очищали по ранее разработанной методике и исследовали электрофоретически и методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Методами лазерного светорассеяния и атомно-силовой микроскопии определен размер частиц, присутствующих в водном растворе этих белков. Установлено, что в водном растворе регуляторные белки образуют наночастицы размером 40-60 нм. Предполагается, что биологическая активность, проявляемая регуляторными белками в сверхмалых дозах, обусловлена их способностью находиться в виде высокомолекулярных устойчивых наночастиц.
Регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах (СМД), обнаружены в крови, тканях глаза и в железах млекопитающих [1-3]. В СМД эти белки влияют на клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток [4, 5]. Показано, что некоторые регуляторные белки являются внеклеточными [6]. Регуляторные белки этой группы увеличивают жизнеспособность клеток в условиях in vitro [4], стимулируют репаративные процессы в патологически измененных тканях [7]. Протекторное действие регуляторных белков обусловлено их способностью влиять на клеточные источники регенерации в тканях взрослых животных [4]. Регуляторные белки данной группы в СМД влияют на свойства плазматической мембраны клеток млекопитающих (вязкоупругие свойства, проницаемость) [2, 3]. Мембранотропное действие регуляторных белков легло в основу метода их биотестирования, с помощью которого активность белков этой группы можно выявлять, например, в процессе очистки [1-3].
Согласно данным аминокислотного анализа, ре-гуляторные белки содержат большое количество дикарбоновых аминокислот - глутаминовой и аспа-рагиновой, а также глицина и серина, незначительное количество остатков серосодержащих и ароматических аминокислот. Определена аминокислотная последовательность 12-членного фрагмента регуляторного белка, выделенного из сыворотки
крови млекопитающих [1-3, 8]. Этот регулятор-ный белок содержит остатки маннозы и А-ацетил-гюкозамина [2, 8].
Регуляторные белки - низкомолекулярные, гли-козилированые (А-олигоманнозидные цепи) белки, исключительно устойчивые к воздействию ряда физико-химических факторов, например к экстремальным значениям температуры и рН, а также к солевому составу среды [3].
В настоящей работе предпринята попытка идентифицировать биологически активные в СМД регуляторные белки в тканях печени, легкого, почек, тонкого кишечника млекопитающих, а также желчи. Мы применяли разработанную ранее методику выделения и очистки регуляторных белков из тканей позвоночных животных [2, 3]. Кроме того, изучен ряд физико-химических свойств регуляторных белков, в частности определен размер их частиц в водном растворе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследование проводили на крысах Wistar (весом 210-230 г), гибридных мышах CBA/C57B1 первого поколения (самцы, 20-22 г), которых содержали в виварии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Использовали также желчь медицинскую консервированную (крупного рогатого скота), приобретенную в аптеках г. Москвы.
Все химические реактивы соответствовали марке "х.ч". Использовали деионизованную воду категории MilliQ (15 МОм).
Тканевые экстракты получали по ранее разработанной методике [1, 3].
В работе исследовали экстракты тканей органов, выделенных из 50 крыс.
Крыс декапитировали под эфирным наркозом, вскрывали брюшную полость, печень перфузиро-вали через портальную вену 10 мл физиологического раствора, удаляя основную массу крови. Печень извлекали, разрезали на фрагменты размером приблизительно 0.3-0.5 см3 и помещали на 2-2.5 ч при 4-8°С в физиологический раствор следующего состава: 0.15 М NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES. Затем извлекали легкие и разрезали их на фрагменты размером 0.3-0.5 см3 и тонкий кишечник, который разрезали вдоль, а затем на кусочки 1-1.5 см, промывали в физиологическом растворе и получали тканевые экстракты в таких же условиях, как экстракты печени. Экстракты центрифугировали (3000g, 10 мин) и разделяли по ранее разработанной методике, включающей двукратное высаливание белков в насыщенном растворе сернокислого аммония и изоэлектрофоку-сирование (ИЭФ) [2, 3]. Наличие белков во фракциях детектировали спектрофотометрически при 280 нм, определяли рН каждой фракции.
К медицинской желчи (2 л) постепенно при перемешивании добавляли 1700 г сернокислого аммония. Смесь оставляли на 7 сут при 4-8°С. Затем фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат, представляющий собой бесцветную жидкость, диализовали против воды до полного удаления ионов аммония, доводили до объема 10 мл, используя вакуумный роторный испаритель (40°С), повторно высаливали, диализовали и концентрировали. Полученный после двукратного высаливания раствор разделяли методом ИЭФ.
После ИЭФ препаратов были собраны фракции с рН менее 3.0: № 1 - белки печени; № 2 - белки легкого; № 3 - белки тонкого кишечника; № 4 -белки почек; № 5 - белки желчи. После удаления сахарозы и амфолинов диализом против воды фракции лиофильно высушивали, растворяли в 1 мл воды и исследовали.
Регуляторные белки во фракциях идентифицировали с помощью адгезиометрического метода (метод биотестирования) [1-3, 6, 8]. Этот метод позволяет оценить вязкоупругие свойства ткани при стандартном деформационном воздействии. Для получения культуры ткани печени использовали самцов гибридных мышей первого поколения СВА/С57В1 весом 15-18 г в возрасте около 3 мес. После декапитации животного из печени вырезали фрагменты весом 1.0-1.5 мг. В пенициллиновые флаконы, содержащие 0.9 мл среды 199 и 0.1 мл раствора препарата белка в соответствующей кон-
центрации, помещали по пять фрагментов печени. Интервал активных концентраций каждого препарата белка определяли, исследуя биологическое действие его растворов (последовательное разведение в 10, 100, 1000 раз и т.д.). Для этого брали исходный раствор белка известной концентрации (0.1 мл), добавляли среду 199 (0.9 мл) и встряхивали 10-15 раз. Отбирали 0.1 мл раствора и добавляли 0.9 мл среды 199 и т.д. В контрольные флаконы вместо белка добавляли 0.1 мл физиологического раствора. Органные культуры инкубировали в среде 199 с исследуемым белком и без него в течение 2 ч при 37°С. Фрагмент ткани вынимали, быстро осушали фильтровальной бумагой, взвешивали и разрушали в 0.1 мл 0.1% раствора трипанового синего, приготовленного на среде 199, используя дезинтегратор ткани с зазором 50 мкм, в условиях стандартного деформационного воздействия. Клеточные ядра в суспензии клеток подсчитывали в камере Горяева (0.02 мм3). В каждом эксперименте на одну точку (раствор исследуемого препарата определенной концентрации и контроль) просчитывали не менее пяти фрагментов ткани. Биологический эффект рассчитывали по формуле: Эа = = 200% - [(Лоп/Лк) х 100%], где Эа - биологический эффект, вызываемый белковым препаратом; Лоп и Лк - количество клеточных ядер, выделившихся в результате деформационного воздействия из 1 мг ткани в опыте (тканевые культуры в присутствии белкового препарата) и в контроле (тканевые культуры без белкового препарата) [1-3, 8]. Каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз.
Количество белка во фракциях определяли с использованием бицинхониновой кислоты согласно [9].
Молекулярную массу белков определяли с помощью электрофореза в 12% ПААГ в присутствии 0.1% додецилсульфата натрия на приборе для вертикального электрофореза Mini Protean-3 ("BioRad", Италия) [10]. В качестве маркеров молекулярной массы использовали фосфорилазу b (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (45 кДа), карбоангидразу (30 кДа), соевый ингибитор трипсина (20 кДа), лизоцим куриный (14.4 кДа) ("LKB", Швеция).
Биологически активные регуляторные белки разделяли посредством электрофореза в неденату-рирующих условиях [11]. Из геля вырезали полосу со значением Rf 0.90 ± 0.05, белки элюировали несколько раз небольшим количеством воды. Элюа-ты собирали, объединяли, диализовали многократно против воды, лиофильно высушивали, вновь растворяли в воде. Методом биотестирования определяли наличие активности и изучали физико-химические свойства.
ВЭЖХ элюатов, полученных после электрофореза, проводили на приборе Agilent 1100 Series (США). Условия хроматографии: колонка Био-
pHOO 10
6 4 2 0
15 20
N
Рис. 1. Изоэлектрофокусирование супернатанта тканевого экстракта тонкого кишечника крыс. N - номер фракции.
химмак С8-200 (4.6 х 150 мм); градиент: вода (В-0.1% трифторуксусная кислота)-ацетонитрил (А), который подавали в следующем режиме: 6 мин - 0%; 12 мин - 80%; 16 мин - 80%; 20 мин -0%.
Гидродинамический радиус частиц в растворах фракций № 1-5, полученных ИЭФ, определяли методом динамического рассеяния света на приборе "PhotoCor Complex" ("ФотоКор", Россия), снабженном автоматическим гониометром, мульти-временным коррелятором реального времени "PhotoCor-FC" и гелий-неоновым лазером "Uniphase 1135P" мощностью 20 мВт (к = 633 нм) в качестве источника света. Измерения проводили при угле рассеяния 90° и температуре 25°С. Пыль из растворов удаляли путем фильтрования через мембраны "Durapore" с диаметром пор 0.45 мкм ("Millipore"). Определяли гомодинную корреляционную функцию интенсивности G(2)(t) в интервале времен задержки от 2 х 10-8 до 103 с [12]. Распределение по временам корреляци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.