МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 846-848
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.84
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ШТАММОВ МЕТИУЬОБАСТЕЯШМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИКВЕНС-АНАЛИЗА ГЕНОВ 168 рРНК
© 2004 г. В. А. Романовская1, П. В. Рокитко, С. О. Шилин, Н. А. Черная, Ю. Р. Малашенко
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
Поступила в редакцию 11.08.03 г.
Видовая диагностика бактерий рода Methylobac-terium затруднена, т. к. практически отсутствуют фенотипические признаки, которые дифференцируют виды данного рода. Цель работы - идентифицировать новые изоляты метилотрофных бактерий, используя сиквенс-анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. При этом мы руководствовались рекомендациями Международного комитета, согласно которым количество неидентифицированных нуклеотидов не должно превышать 0.5% от их общего числа [1].
Объекты исследования - метилотрофные бактерии, выделенные нами из почвы ЧАЭС (UCM В-3362, UCM В-3389) или филлосферы растений: UCM В-3368 и UCM В-3383 (листья Vitis sp.), UCM В-3360 (листья Trifolium pratense) [2, 3]. Первичную идентификацию бактерий проводили на основании изучения их морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств общепринятыми методами, приведенными в руководстве [4] и в работе [2].
Выделение клеточной ДНК проводили методом, который описан в руководстве [5], амплификацию последовательностей гена 16S рРНК по работе [6]. Ген 16S рРНК амплифицировали, используя универсальные для большинства эубак-терий олигонуклеотидные праймеры (27f и 1492г) [6]. ПЦР проводили на термальном циклере Gene Amp PCR System 2400 ("Perkin Elmer"), используя стандартный набор реактивов (DTCS Master Mix), который придается к материальному обеспечению сиквенатора CEQ 2000XL ("Beckman Coulter"). Проводили 30 циклов амплификации следующего температурного профиля: денатурацию ДНК (96°C, 20 с), отжиг праймеров (50°C, 20 с), элонгацию (60°C, 4 мин). Сиквенирование амплифици-рованых генов 16S рРНК проводили в обоих направлениях, с помощью прямого и обратного праймеров (27f и 1492r), на сиквенаторе CEQ 2000XL ("Beckman Coulter") с использованием прилагающегося набора реактивов (CEQ DTCS Kit), согласно рекомендациям производителя. Для сравнительного филогенетического анализа в базе
1 Автор для корреспонденции (e-mail: malashen-ko@serv.imv.kiev.ua).
данных GenBank были взяты последовательности генов 16S рРНК 14 видов Methylobacterium: M. or-ganophilum JCM 2833T (D32226), M. extorquens JCM 2802T (D32224), M. rhodesianum JCM 2810T (D32228), M. zatmanii JCM 2819 (D32230), M. rhod-inum JCM 2811T (D32229), M. mesophilicum JCM 2829T (AJ400919), M. radiotolerans JCM 2831T (D32227), M. fujisawaense DSM 5686 (AJ250801), M. suomiense NCIMB13778T (AY009404), M. lusi-tanum NCIMB13779T (AY009403), M. dichlo-romethanicum DSM6343T (AF227128), M. nodulans ORS1924 (AF220762), M. chloromethanicum CM4 (AF198624), M. podarium (AF514774).
Согласно основным диагностическим признакам розовоокрашенные факультативные метано-лиспользующие бактерии, изолированные нами из почвы и филлосферы растений, были причислены к роду Methylobacterium. Изучение их мор-фолого-культуральных и физиолого-биохимиче-ских свойств позволило штаммы UCM В-3360, UCM В-3368 идентифицировать как M. extorquens. Видовая принадлежность остальных штаммов не была установлена. Из биомассы бактерий были получены препараты ДНК. Методом горизонтального электрофореза [7] и спектрофотомет-рическим методом [8] было показано, что выделенные препараты ДНК достаточно чистые и пригодны для дальнейшей работы. С помощью ПЦР были получены препараты гена 16S рРНК, которые далее были сиквенированы. Нуклеотид-ные последовательности генов 16S рРНК изучаемых бактерий депонированы в GenBank (номер доступа в GenBank приведен в скобках): UCM В-3360 (AY460189), UCM В-3362 (AY365229), UCM В-3368 (AY366072), UCM В-3383 (AY366073), UCM В-3389 (AY460187).
Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК изучаемых бактерий с таковыми последовательностями различных видов бактерий в базе данных GenBank, проведенный с помощью программы BLASTN 2.2.4, показал, что они относятся к классу Proteobacteria, в частности, к роду Methylobacterium. Уровень сходства штамма UCM В-3383 с M. mesophilicum составлял 99.4%; штамма UCM В-3389 с M. organophilum - 98.5%; штаммов UCM В-3360, UCM В-3362, UCM В-3368
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ШТАММОВ METHYLOBACTERIUM
847
Бескорневое дерево, показывающее формирование кластеров видов Methylobacterium, основанное на анализе последовательностей генов 16S рРНК. Сиквенс генов 16S рРНК 14 видов Methylobacterium взят в базе данных GenBank, сик-венс генов 16S рРНК штаммов UCM В-3360, UCM В-3362, UCM В-3368, UCM В-3383, UCM В-3389 - собственные данные. Пунктиром показаны сформировавшиеся кластеры, штаммы которых характеризуются высоким уровнем сходства. Масштаб (0.01) соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. UCM - Ukrainian Collection of Microorganisms, Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев.
с M. extorquens - 97.7-99.4%, что позволило отнести их к этим видам. С другими видами рода Methylobacterium эти штаммы имели низкий уровень сходства - 93-96%.
Построение филогенетического дерева, основанного на сравнении генов 16S рРНК, проводили с использованием различных алгоритмов, реализованных в пакетах программ Tree View (версия 1.5.2) и ClustalX (версия 1.81). Показано, что штаммы UCM В-3360, UCM В-3362 и UCM В-3368 образуют монофилетический кластер с M. ex-torquens, M. zatmanii, M. rhodesianum (рисунок). Уровень сходства этих трёх видов составлял 99.4 -98.4%. Вид M. chloromethanicum также попадает в
этот кластер, хотя и с более низким уровнем сходства (97.6-98.3) с различными штаммами M. ex-^щжт. Второй компактный кластер сформировали виды M. mesophШcum, M. fujisawaense, M. т-diotolerans (рисунок), уровень их сходства - 98.997.8%. Таким образом, виды внутри каждого из этих кластеров близки по уровню сходства генов 16Б рРНК (более 97.5%) и по фенотипическим свойствам. Они также имеют достаточно высокий уровень сходства тотальной ДНК (33-43%) [8]. Такое высокое филогенетическое родство видов внутри каждого кластера скорее свидетельствует о штаммовых (а не о видовых) различиях. Приведенные данные позволяют усомниться в
МИКРОБИОЛОГИЯ том 73 < 6 2004
848
РОМАНОВСКАЯ и др.
правомочности самостоятельного существования некоторых из этих видов рода Methylobacterium.
Изолированные нами метилотрофные бактерии на основании результатов сиквенс-анализа гена 16S рРНК и изучения фенотипических признаков отнесены к видам: Methylobacterium meso-philicum (штамм UCM В-3383), M. extorquens (штаммы UCM В-3360, UCM В-3362, UCM В-3368) и M. organophilum (штамм UCM В-3389).
Работа выполнена при частичном финансировании объекта национального достояния "Коллекция микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Stackebrandt E., Frederiksen W., Garrity G.M., Grimont P.A.D., Kampfer P ., Maiden M.C.J., Nesme X., Rossello-Mora R., Swings J, Trüper H.G., Vauterin L., Ward A.C., Whitman W.B. Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. № 3. P. 1043-1047.
2. Романовская B.A., Столяр C.M., Малашенко Ю Р. Распространение бактерий рода Methylobacterium в различных экосистемах Украины // Микробиол. журн. 1996. T. 58. № 3. С. 3-11.
3. Романовская B.A., Рокитко П.В., Михеев A.H, Гуща НИ, Малашенко Ю Р, Черная H.A. Влияние у-излучения и дегидратации на выживаемость бактерий, изолированных из зоны отчуждения Чернобыльской АЭС // Микробиология. 2002. T. 71. № 5. С. 705-712.
4. Методы общей бактериологии / Под ред. Еерхард Ф. и др. М.: Мир, 1983. Т. 1. 536 с.
5. Current protocols in molecular biology / Eds. Ausubell F. et al. New York: John Wiley & Sons, 1987.
6. Lane D.E. 16S/23S rRNA sequencing // Nucleic acid techniques in bacterial systematics / Eds. Stakebrandt E., Goodfellow M. New York: Wiley, 1991. P. 115-147.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.
8. Marmur J., Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denatur-ation temperature // J. Mol. Biol. 1962. V. 5. P. 109-118.
9. Hood D.W., Dow C.S., Green P.N. DNA:DNA hybridization studies on the pink-pigmented facultative methylotrophs // J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. № 3. P. 709-720.
МИКРОБИОЛОГИЯ том 73 < 6 2004
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.