ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 463, № 3, с. 353-357
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 581.526.325.2
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТОКСИЧНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИИ
В ОЗЕРЕ БАЙКАЛ
© 2015 г. О. И. Белых, А. С. Гладких, Е. Г. Сороковикова, И. В. Тихонова, Т. В. Бутина
Представлено академиком РАН М.А. Грачевым 29.05.2014 г.
Поступило 10.06.2014 г.
Впервые в оз. Байкал в прибрежной зоне около пос. Турка, где ведется строительство туристско-ре-креационной зоны, обнаружены цианобактерии родов Anabaena и Microcystis, содержащие гены синтеза микроцистинов — гепатотоксичных цианотоксинов. Концентрация микроцистинов в воде по данным иммуноферментного анализа составила 0.17 ± 0.01 мкг/л.
DOI: 10.7868/S0869565215210227
Цианобактерии — одни из самых древних на Земле организмов (возраст около 3.8 млрд лет) — широко распространены во всех экосистемах, включая экстремальные, благодаря способности сочетать два важнейших процесса в биосфере: ок-сигенный фотосинтез и фиксацию молекулярного азота. Эти микроорганизмы синтезируют широкий ряд вторичных метаболитов, среди которых имеются как ценные в биомедицинском отношении соединения, так и токсины, представляющие при массовом развитии цианобактерий особую опасность. Показано, что около 60% цветений воды цианобактериями оказываются токсичными [1].
Наиболее распространенными токсинами в пресных водах являются микроцистины (МС) — циклические гептапептиды, синтезируемые ци-анобактериями родов Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Anabaenopsis, Nostoc, Gloeotrichia и Hapalosiphon [1, 2]. Продукция МС осуществляется мультиферментным комплексом — микроци-стинсинтетазой, которая кодируется кластером генов (mcyA-J) модульной структуры. МС поражают клетки печени, ингибируя серин/треонин-специфичные фосфатазы, что приводит к гипер-фосфорилированию белков цитоскелета гепато-цитов, потере клеточных контактов и возникновению обширных кровоизлияний в печени [1, 2]. В настоящее время выявлено около 100 изоформ МС, из которых МС-LR является наиболее ток-
Лимнологический институт
Сибирского отделения Российской Академии наук,
Иркутск
E-mail: belykh@lin.irk.ru
сичным [3]. Согласно рекомендации ВОЗ, концентрация МС-ЬЯ в питьевой воде не должна превышать 1 мкг/л для одноразового приема и 2— 4 мкг/л в воде для купания [4].
Байкал — крупнейшее озеро в мире, природный резервуар чистой пресной воды. В нем сосредоточено более 80% пресных вод России и около 20% мировых запасов. На оз. Байкал и водоемах Байкальского региона нами впервые в России начаты молекулярно- биологические исследования токсичных цианобактерий. В 2005 г. с помощью генетических маркёров в водохранилищах р. Ангара найдены цианобактерии, содержащие гены синтеза МС [5, 6]. В оз. Байкал токсиногенные виды в тот период исследований мы не обнаружили.
Вместе с тем наличие в Байкале хорошо прогреваемых в летнее время заливов и мелководий в сочетании с постоянно растущей антропогенной нагрузкой, вызванной интенсивным развитием туризма и рекреационной деятельности, и, как следствие, — массовое развитие цианобактерий, послужили причиной непрерывного мониторинга планктона озера (2005—2010 гг.).
Целью настоящей работы стало выявление в оз. Байкал цианотоксинов методом иммуноферментного анализа (ИФА) и потенциально токсичных цианобактерий с помощью генетического маркёра — гена тсуЕ, кодирующего домен ами-нотрансферазы (АМТ). Этот фермент входит в состав всех известных микроцистинсинтетаз и играет ключевую роль в биосинтезе МС [6]. Для выявления доминирующих генотипов цианобак-терий проводили метагеномный анализ микробного сообщества по фрагменту гена 168 рРНК с применением технологии "454-пиросеквениро-вание".
80%
60%
40%
20%
0%
Cyanobacteria
Proteobacteria
Actinobacteria
Planctomycetes
Verrucomicrobia
Deinococcus-Thermus
Chloroflexi
другие
Турка
Ухан-Тонкий
Рис. 1. Метагеномный анализ бактериальных сообществ планктона из прибрежной зоны пос. Турка и станции Ухан-Тонкий по данным пиросеквенирования последовательностей фрагмента гена 168 рРНК.
Пробы планктона были отобраны в августе 2010 г. в Среднем Байкале: в пелагиали на середине разреза м. Ухан—м. Тонкий (глубина 1562 м) и в прибрежной зоне около пос. Турка в месте впадения в озеро р. Турка (глубина 7 м). Приустьевая зона характеризуется более высокой концентрацией биогенов и биомассой фитопланктона по сравнению с пелагиалью [7]. В районе пос. Турка с 2010 г. ведется строительство объектов турист-ско-рекреационного комплекса "Байкальская гавань", которая станет также первым современным портом на восточном побережье оз. Байкал.
Пробы планктона отбирали батометрами от поверхности до глубины 25 м через каждые 5 м. Одновременно измеряли температуру и прозрачность воды по диску Секки. Для молекулярно-ге-нетических исследований пробы объемом 1 л фильтровали через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 0.2 мкм ("Millipore", США). ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Выявление участка гена mcyE, кодирующего АМТ-домен, выполняли с помощью праймеров hepF и hepR, как описано ранее [6, 8]. Полученные последовательности были депонированы в GenBank под номерами JF837306— 11. Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали эубактериальные праймеры 9F и 541R [9]. Пиросеквенирование произведено компанией "ChunLab Inc." (Республика Корея) на приборе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titani-
um ("Roche Diagnostics Corporation", Швейцария). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей ЩП) проводили согласно алгоритму, предложенному ранее [6, 10].
Hяличие МС в воде определяли методом ИФА, используя набор Microcystins-ADDA ELISA ("Abraxis LLC", США). Обработку результатов проводили с помощью программы RIDA® SOFT Win.
В августе 2010 г. температура воды в пелагиали составляла на поверхности 9.3°C, на глубине 25 м — — 5.9°C, прозрачность воды была 6 м. В прибрежной зоне у пос. Турка температура воды достигала на поверхности 14°C, у дна — 12.8°C, прозрачность составляла 3.2 м.
В образцах литоральной зоны методом пиросеквенирования выявлено 1906 HП фрагмента гена 16S рPHК, принадлежащих домену Bacteria. Большинство последовательностей отнесены к филам Cyanobacteria, Proteobacteria, Actinobacteria, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Deinococcus-Thermus, Chloroflexi, Bacteroidetes, Acidobacteria, Firmicutes и Armatimonadetes (рис. 1). Восемь последовательностей принадлежали фантомным филам. Всего выявлен 191 филотип, видовое богатство Chao1 составило 370 (кластерное расстояние 0.03). Основу сообщества формировали филы Cyanobacteria и Proteobacteria, достигая соответственно 50 и 42% от общего числа H^ Среди ци-анобактерий доминировали пикопланктонные
рода Synechococcus (729 НП), Cyanobium (119 НП) и Cyanobacterium (26 НП). Из крупноклеточных видов в прибрежном сообществе выявлены Anabaena flos-aquae, A. lemmermannii, A. solitaria, Gloeotrichia echinulata, Microcystis sp., M. aeruginosa, Chamaesiphon sp., Phormidium sp., Tolypothrix sp.
В образцах пелагиали обнаружено 2030 НП фрагмента гена 16S рРНК, принадлежащих домену Bacteria, представляющих в основном филы Cyanobacteria, Proteobacteria, Actinobacteria, Ver-rucomicrobia и Planctomycetes. Минорными филами были Bacteroidetes, Thermobaculum_p, Armati-monadetes, Acidobacteria, TM7 и GN02. Ци-анобактерии составляли более 75% сообщества, Proteobacteria и Actinobacteria — 11 и 10% соответственно. Показатели видового разнообразия бак-териопланктона в пелагиали и литорали оказались сходными: в пелагических образцах выявлено 198 филотипов, коэффициент Chao1 составлял 405. Доминирующим филотипом на глубоководной станции был Synechococcus sp. (1346 НП, 66.3%), на долю видов Cyanobium и Cyanobacterium приходилось 178 НП (8.8%). Нанопланктонные представители в пелагиали озера не найдены. Следует отметить, что в июле—августе в оз. Байкал ежегодно наблюдается массовое развитие пи-коцианобактерий, их вклад в общую численность бактерий составляет 60% [7]. Однако в июне мик-робиом определяют филы Bacteroidetes, Actino- и Proteobacteria [10].
Таким образом, анализ микробного разнообразия показал, что вклад нетоксичных пикоци-анобактерий в прибрежное сообщество составлял более 90%, на долю потенциально токсичных Microcystis и Anabaena приходилось 3%, в пелагиали 100% генотипов были представлены пикоци-анобактериями. Наши данные, полученные в литорали, сходны с таковыми в озерах Эри и Сент-Мэрис, где во время токсичных цветений по данным метагеномного анализа до 70% НП принадлежали пикоцианобактериям, а Microcystis spp. — основной продуцент МС — составлял менее 3% [11].
В ПЦР с использованием в качестве матрицы суммарной ДНК фитопланктона и праймеров к гену АМТ-домена получен положительный ответ в пробах, отобранных в литорали, и отрицательный ответ — в образцах с глубоководной станции. Пятьдесят клонов, полученных из положительных проб, представляют 6 разных генотипов, половина из которых имеет 99%-е сходство с НП рода Microcystis, остальные — с родом Anabaena. На филогенетических схемах НП АМТ-домена формируют устойчивые кластеры, соответствующие отдельным родам цианобактерий, продуцирующим МС [6, 8]. В кластере Microcystis байкальские генотипы BaT10-3 и BaT10-9 группируются вместе с M. wesenbergii NIES-107 из оз. Кавагучи, а BaT10-12 — с Microcystis sp. B5-4 из Балтийского
моря (рис. 2). В кластере Anabaena НП BaT10-1 родственна изоляту из оз. Котокельское и штаммами Anabaena из скандинавских озер и Балтийского моря, а BaT10-13 и 10-14 формируют отдельные линии.
Таким образом, впервые за период наблюдений с 2005 по 2010 гг. в оз. Байкал выявлены гены синтеза МС, принадлежащие видам Microcystis и Anabaena.
Концентрация МС в районе пос. Турка составила 0.17 ± 0.01 мкг/л, что значительно ниже порога, установленного для питьевой воды. В пела-гиали озера МС не обнаружены. Концентрация МС в Байкале очень низкая даже по сравнению с другими холодноводными озерами, где также найдены токсичные виды Anabaena и Microcystis. Так, в финских озерах максимальная концентрация МС достигала 5200 мкг/л [1, 12]. Известно, что температура окружающей среды
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.