МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 3, с. 331-343
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.21:579.871
ИДЕНТИФИКАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА DIETZIA ИЗ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ НА ОСНОВЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ И АНАЛИЗА ГЕНОВ 16S рРНК И gyrB
© 2015 г. Т. Н. Назина*, Е. C. Шумкова**, Д. Ш. Соколова*, Т. Л. Бабич*, М. В. Журина*, Я.-Ф. Сюэ***, Г. А. Осипов****, А. Б. Полтараус**, Т. П. Турова*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва ***Институт микробиологии Китайской Академии Наук, Пекин, КНР ****Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева, Москва Поступила в редакцию 25.08.2014 г.
Таксономическое положение углеводородокисляющих бактерий, штаммов 263 и 32d, выделенных из пластовой воды нефтяного месторождения Дацин (КНР), определено с использованием методов полифазной таксономии, включая анализ генов 16S рРНК и gyrB. Оба штамма имели основные хе-мотаксономические характеристики, свойственные представителям рода Dietzia, в том числе, IV тип клеточной стенки, состав жирных кислот клеточной стенки, миколовых кислот и менахинонов. Содержание Г + Ц в ДНК штаммов 263 и 32d составляло 67.8 и 67.6 мол. % соответственно. Филогенетический анализ гена 16S рРНК штамма 32d выявил 99.7% сходства с геном D. maris, что позволяло отнести штамм 32d к этому виду. Последовательность гена 16S рРНК штамма 263 имела 99.7 и 99.9% сходства с генами D. natronolimnaea и D. cercidiphylli YIM65002T соответственно. Анализ гена gyrB подземных изолятов и ряда типовых штаммов рода Dietzia подтвердил принадлежность штамма 32d к виду D. maris и штамма 263 — к виду D. natronolimnaea. Сделан вывод о более высокой разрешающей способности филогенетического анализа гена gyrB по сравнению с анализом гена 16S рРНК в определении видовой принадлежности бактерий рода Dietzia.
Ключевые слова: актинобактерии, Dietzia natronolimnaea, Dietzia maris, таксономия, нефтяные пласты, гены 16S рРНК и gyrB, праймеры для амплификации и секвенирования генов gyrB бактерий рода Dietzia.
DOI: 10.7868/S0026365615030143
Одним из наиболее перспективных таксономических (филогенетических) маркеров, альтернативных гену 16S рРНК, являются гены ДНК то-поизомераз II типа, в функцию которых входит решение проблем топологии ДНК. Геном бактерий содержит два гомологичных фермента этого типа, гиразу и топоизомеразу IV, состоящих из двух субъединиц каждый и содержащих в сумме 1200—1500 аминокислот, что статистически достаточно для филогенетического анализа. В качестве филогенетического маркера наиболее широко используется ген бета-субъединицы гиразы (gyrB). Для ряда групп бактерий показано, что горизонтальная трансмиссия гена gyrB имеет такую же скорость, что и рибосомных генов [1], и скорость замены пар оснований в гене gyrB коррелирует с данными ДНК-ДНК гибридизации [2, 3]. С помощью анализа сходства последовательностей
1Автор для корреспонденции: (e-mail: nazina@inmi.host.ru).
гена gyrB были успешно разделены штаммы таких проблемных родов, как Pseudomonas [4, 5], Bacillus [6], Acinetobacter [7], Gordonia [8] и Geoba-cillus [9].
Одним из аналогичных проблемных родов является также род Dietzia, виды которого имеют относительно невысокую степень дивергенции последовательностей генов 16S рРНК, поэтому их филогенетическая идентификация затруднена. В настоящее время род Dietzia включает двенадцать видов: D. maris [10, 11], D. natronolimnaea [12], D. psychralcaliphila [13], D. kunjamensis [14], D. cin-namea [15], D. papillomatosis [16], D. schimae и D. cercidiphylli [17], D. lutea [18], D. aerolata [19], D. timorensis [20] и D. alimentaria [21]. Эти бактерии выделяли из почв, пресноводных и соленых местообитаний, с поверхности рыб и растений и из клинических проб. Отмечается способность некоторых представителей этого рода разрушать алифатические углеводороды и ароматические
соединения, что позволяет рекомендовать их для биоремедиации загрязненных нефтью местообитаний при низкой температуре и в широком интервале pH [13, 22, 23]. Работ, посвященных изучению коринебактерий из нефтяных пластов, очень мало, что и обусловило необходимость выполнения настоящей работы [24, 25].
Штаммы 32d и 263 были выделены из пластовой воды нефтяного месторождения Дацин на среде со смесью жидких C12—C22 парафинов [26]. Оба штамма продуцировали поверхностно-активные вещества и снижали поверхностное и межфазное натяжение культуральной среды при росте на углеводородах [27]. Микробиологическая и физико-химическая характеристика обследованных нефтяных пластов Дацина и результаты определения таксономического положения бактерий приведены ранее [26, 28]. В результате первичного анализа гена 16S рРНК показано филогенетическое родство штаммов 32d и 263 бактериям D. maris и D. natronolimnaea соответственно. На основании фенотипических характеристик и анализа полной последовательности гена 16S рРНК штамм 32d был отнесен к виду D. maris, а штамм 263, формирующий слизистые и шероховатые колонии, был предварительно отнесен к новому виду 'Dietzia daqingensis' [Acc. nos. AY603001, AY603002].
Целью работы было описание физиолого-био-химических свойств и таксономии углеводородо-кисляющих бактерий рода Dietzia, штаммов 32d и 263, с использованием фенотипических и хемо-таксономических характеристик и анализа генов 16S рРНК и gyrB.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы и их культивирование.
В работе исследовали штаммы 32d и 263, выделенные из нефтяного месторождения Дацин [26]. Штаммы 32d и 263 были депонированы в международную коллекцию DSMZ в 2003 году под номерами DSM 44747 и DSM 44748, соответственно. Кроме того, для сравнительного анализа использовали типовые штаммы D. psychralcaliphila JCM10987T и D. natronolimnaea JCM 11417T, полученные из японской коллекции [The Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN), Wako, Japan], а также штаммы D. maris DSM 43672T и Ko-curia rosea DSM 20477T, полученные из немецкой коллекции [DSMZ, the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen].
Морфологию клеток, окрашивание по Граму, спектр используемых субстратов, гидролиз желатина, крахмала и казеина, образование индола и сероводорода, тест с метиловым красным, содержание Г + Ц в ДНК, уровень ДНК-ДНК-гибридизации и состав клеточных жирных кислот
анализировали как описано ранее [29]. Хемотип клеточной стенки штаммов 263 и 32d определяли известным методом [30]. Состав миколовых кислот и изопреноидных хинонов определяли, как указано ранее [31, 32].
Выделение ДНК и амплификация исследуемых генов. ДНК выделяли из единичных колоний, выросших на среде Plate Count Agar (PCA, "Sigma", США), используя набор "DiatomtmDNAprep" ("Биоком", Россия) согласно рекомендациям фирмы изготовителя с небольшими модификациями. Амплификацию генов 16S рРНК проводили по стандартной методике с использованием универсальных праймеров [33].
Амплификацию гена gyrB проводили в 2 этапа: 1) амплификация с помощью вырожденных праймеров Up-1D и Up-2rD [4]; 2) реамплифика-ция ПЦР продуктов с праймерами Up-1sD_3 и Up-2srD, комплементарными 5'-области вырожденных праймеров Up-1D и Up-2rD, либо со специально сконструированным для Dietzia прямым gyrB-f583_4 (5'-gatc CAC CMS ACS ATC CTS TAC TT-3') и обратным праймером gyrB-r772 (5'-ctt Stc Scg Sgc gta Ytt gtt-3') в сочетании с праймерами Up-1sD_3 или Up-2srD.
Для секвенирования использовали Up-1sD_3, Up-2srD, gyrB-r772, gyrB-f583_4, а также подобранные для Dietzia прямой gyrB-f412 (5'-cgсgtc-gaggtBSagatcaa-3') и обратный gyrB-r1525 (5'-gcag-gatcgcctggaacat-3') праймеры.
Подбор праймеров и секвенирование последовательности гена gyrB бактерий рода Dietzia. Для
идентификации штаммов рода Dietzia по нуклео-тидным последовательностям гена gyrB, кодирующего ДНК-гиразу, были подобраны следующие праймеры: gyrB-f412: 5'-cgсgtcgaggtBSagatcaa-3' и gyrB-r1525: 5'-gcaggatcgcctggaacat-3'. Олигонук-леотиды подбирали к консервативным участкам гена gyrB (рис. 1) на основе выравнивания 26-ти известных последовательностей гена gyrB бактерий рода Dietzia. Последовательности выравнивали с использованием программы CLUSTALW v. 1.75, подбор праймеров осуществляли вручную. Термодинамические параметры и вторичную структуру праймеров проверяли в Oligo Analyzer 3.1 (http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligo-analyzer/). Специфичность праймеров анализировали с помощью алгоритма PrimerBLAST. Диапазон температуры плавления (Tm) для вырожденного праймера gyrB-f412 составил 57.3—60.1°C (средняя Tm — 58.8°C), для gyrB-r1525 температура плавления (Tm) составила 57.9°C. В связи с этим, рекомендуемая температура отжига прай-меров (Ta) — 55°C. ПЦР осуществляли при следующих условиях: 95°C — 3 мин; 30 циклов: 94°C — 30 с, 55°C - 30 с, 72° C - 40 с; 72°C - 7 мин (табл. 1). Положение праймеров показано на рис. 1. Подобранные праймеры позволяют амплифицировать
0.664
Сходство, ед Up-1| Ulli gyrB-f41 ПН gyrB-r1525 —i- |Up-2R i-1
1 400 800 1200 1600 2000
п.н.
Рис. 1. Степень консервативности нуклеотидных последовательностей гена ^утВ бактерий рода Б1&11а и положение праймеров. Черным цветом выделены праймеры, предложенные ранее [4], белым — подобранные нами праймеры.
протяженный участок (1113 п.н.) гена gyrB, включая его максимально вариабельные участки, что необходимо для идентификации бактерий.
Секвенирование полученных ПЦР-продуктов проводили на секвенаторе ABI 3100 Avant Genetic Analyser ("Applied Biosystems", США) с использованием набора Dyenamic Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ("Amersham", Великобритания).
Филогенетический анализ. Первичный анализ полученных последовательностей проводили с
использованием программы BLAST сервера NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Нуклеотидные последовательности выравнивали с таковыми, содержащимися в генетическом банке, используя программу CLUSTALX 2.0 [http://bips.u-strasbg.fr/fr/Docu-mentation/ClustalX/]. Филогенетические деревья конструировали по методу ближайших соседей с помощью пакета программ TREECONW [http://
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.