научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ В РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ СЕТЧАТКЕ ТРИТОНА ГЕНА-РЕГУЛЯТОРА ЭМБРИОГЕНЕЗА PITX1 Математика

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ В РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ СЕТЧАТКЕ ТРИТОНА ГЕНА-РЕГУЛЯТОРА ЭМБРИОГЕНЕЗА PITX1»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 435, № 3, с. 420-423

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 577.29; 57.086.088; 617.7

ИДЕНТИФИКАЦИЯ В РЕГЕНЕРИРУЮЩЕМ СЕТЧАТКЕ ТРИТОНА ГЕНА-РЕГУЛЯТОРА ЭМБРИОГЕНЕЗА РШ © 2010 г. Ю. В. Маркитантова, П. П. Авдонин, Э. Н. Григорян, Р. Д. Зиновьева

Представлено академиком М.В. Угрюмовым 06.05.2010 г. Поступило 20.05.2010 г.

Сетчатка тритона является уникальной модельной системой, поскольку возможна ее полная регенерация за счет трансдифференцировки клеток ретинального пигментного эпителия при участии ростовой периферической зоны сетчатки [1]. Процесс регенерации сетчатки осуществляется под контролем координированной работы регуля-торной сети сигнальных молекул и транскрипционных факторов. В регенерирующей сетчатке тритона пока идентифицированы регуляторные гены да, Шек-1, Бкк, ЖШ, Тф, Рахб, Ргох1, Ых3, СН%2, МИх, Скх10, МшазЫ-^ участвующие также в формировании глаза в ходе развития [2—6]. В связи с недостаточной изученностью молекулярных механизмов регенерации сетчатки и генома тритона в целом остается актуальной идентификация генов, которые могут быть вовлечены в контроль приводящих к восстановлению сетчатки клеточных процессов. Особый интерес представляет изучение роли в регенерации сетчатки генов семейства Р11х, кодирующих многофункциональные транскрипционные факторы бикоидного типа. Гомеобокссодержащие гены семейства РИх (РЫх1, РШ2 и Р1Ы3) принимают участие в контроле формирования глаза [7—10]. Экспрессия РИх1, РШ2 и РИх3 обнаружена на ранних стадиях развития эмбрионов в центральной части нервной пластинки, а позже в формирующемся глазном бокале [8, 9, 11]. РИх1 локализован в мигрирующих ме-зенхимных клетках, окружающих глазной зачаток и являющихся источником формирования эндотелия и стромы роговицы, стромы радужки, цилиарных мышц, эндотелия сосудов, склеры [7].

Индуктивные сигналы от клеток окологлазной мезенхимы обеспечивают развитие хрусталика, пигментного эпителия сетчатки, а также зрительного нерва — тканей эктодермального и нейроэк-тодермального происхождения [10]. Показано, что гиперэкспрессия гена РИх1 в клетках окологлазной мезенхимы приводит к снижению уровня

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва

экспрессии генов Ых2, Рахб, участвующих в регуляции меланогенной и нейральной дифференци-ровок клеток, что в свою очередь отражается на уровне экспрессии нейрального маркера — белка микротрубочек Ь-тубулина [11]. Предполагается, что РИх1 может находиться на верхней ступени иерархии регуляторных генов, контролирующих процессы мелано- и нейрогенеза.

Экспрессия другого представителя семейства РИх — гена РШ2 выявлена на ранних стадиях эмбрионального развития мыши в клетках нервного гребня, которые вносят вклад в формирование окологлазной мезенхимы. Области локализации генов Р1Ы1 и РШ2 перекрываются, однако РШ2 имеет более широкий паттерн экспрессии. С применением технологии Сге-Ьох установлена важная роль РШ2 в контроле формирования структур переднего сегмента глаза (роговицы, радужки, цилиарного тела, трабекулярной сети), а также в дифференцировке клеток заднего сегмента глаза (зрительного нерва, пигментного эпителия). Нокаут гена РШ2 приводит к подавлению активности регуляторных генов Рахб, Otx2, М^ [10].

Еще один представитель семейства РИх — ген Р11х3 участвует в формировании хрусталика и сетчатки [8]. Гиперэкспрессия гена Р11х3 на стадии нейрулы у ксенопуса приводит к нарушениям развития глаза, затрагивающим хрусталик, глазной бокал и зрительный нерв. Экспрессия гена Р11х3 в презумптивном хрусталике необходима и для правильного формирования сетчатки, что свидетельствует о важной роли межтканевых взаимодействий [9].

Цель наших исследований состоит в изучении экспрессии генов семейства Р11х при регенерации сетчатки тритона. Мы предполагаем, что между генами семейства Р11х и генами Рахб, Otx2, М^су-ществуют взаимодействия не только в ходе нормального развития глаза, но и при эпиморфной регенерации сетчатки. Задача настоящего этапа исследований заключалась в идентификации гена Р1Ы1 в регенерирующей сетчатке тритона.

Объектом исследования служили взрослые тритоны Р1еигоёе1е8 waltl. После наркотизации в растворе 0.65%-ного ШС1 с Ы8-222 (1 : 1000) уда-

ИДЕНТИФИКАЦИЯ В РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ СЕТЧАТКЕ ТРИТОНА

421

(a)

GCC ACTTTCCAGCGT AACCGCT ACCCGGACATGAGC ATGCGGGAGGAGATCGCAGTCTGG -1-1-1-1-

10

20

30

40

50

60

D..............DD.....................................................□......D.........................D-D......

60 60 60 60 60 60 60

ACCAACCTCACCGAGGCCCGGGTCCGGGTCTGGTTCAAGAACCGCCGAGCCAAGTGGAGG

70

~80~

90

100

110

120

i

ft

*........H.................................utJ:ü

II

..д..

■D-E

4

120 120 120 120 120 120 120

AAGAGGGAGCGCAACCAGCAGATGGACCTGTGCAAGAATGGCTACGTGCCCCAGTTCAGC

130

140

150

160

170

180

..............................................U...........U.........J-4D.....

D-

.д..

..д..

Л

-D-D-

"ix:::

D...........Q--C

GGGCTGA TGCAGCCCT A CGAGG A C A TGT A CGCXGG

~r

190

200

210

•У..........-У-

■.....П....................n.......

»i?.........

80 80 80 80 80 180 180

210 209 212 215 215 215 215

(б)

Гомология, %

1 2 3 4 5 6 7

1 85.6 84.3 85.2 87.1 87.6 89.0 1

2 15.9 88.0 88.0 85.2 86.6 86.1 2

3 17.7 13.0 90.1 87.7 88.2 86.3 3

4 16.6 13.0 10.7 87.4 90.7 89.8 4

5 14.2 16.6 13.5 14.0 90.2 88.8 5

6 13.7 14.8 12.8 10.0 10.5 95.8 6

7 11.9 15.3 15.1 11.0 12.1 4.3 7

1 2 3 4 5 6 7

Pitx1_D. rerio Pitxl G. aculeatus Pitx1_Homo sapiens Pitx1_M. domestica Pitxl P. waltl Pitx1_X. tropicalis Pitxl X. laevis

Рис. 1. а — сравнение нуклеотидных последовательностей наиболее консервативного участка генов позвоночных (1—7), структура нуклеотидной последовательности участка гена из регенерирующей сетчатки тритона приведена полностью, рамки обозначают замены нуклеотидов; б — результаты сравнения нуклеотидной последовательности наиболее консервативного участка гена у разных видов животных, выраженные в процентах.

ляли сетчатку через разрез в дорсальной области глаза. Выделяли тотальную РНК из клеток натив-ной сетчатки и сетчатки на 45-е сутки после ее удаления с помощью реактива TRI® Reagent

("Sigma", США). Тотальную РНК обрабатывали ДНКазой Turbo ("Ambion", США), после чего проводили синтез первой цепи кДНК с использованием обратной транскриптазы M-MLV и ran-

422

МАРКИТАНТОВА и др.

(a)

2

3

4

5

6 7

AT FQRNRY PEMSMREEIAVWTNLT EARVRVWFKNRRAKWRKRERNQQMDLCKNGYVPQF SGLMQPYEEMYAG

10

20

30

40

50

60

70

ATFQRNRYPDMSMREE ATFQRNRYPDMSMREE ATFQRNRYPDMSMREE

atfqrnrypdmST|ree

ATFQRNRYPDMSMREE ATFQRNRYPDMSMREE ATFQRNRYPDMSMREE

IAVWTNLTEARVRVWFKNRRAKWRKRERNQQMDLCKNGYVPQFSGLMQPYEDMYAG

iavwtnltearvrvwfknrrakwrkrernqqmdlckngyvpqfsglmqpYDEImyac

IAVWTNLTEARVRVWFKNRRAKWRKRERNQQMDLCKNGYVPQFSGLMQPY DE MYAG

I AVWTNLTEARVRVWFKNRRAKWRKRERNQQMDLCKNSYLIPQFSGLMQPY DD V

I AVWTNLT||PRVRVWFKNRRAKWRKRERNQQMDLCKNGYVPQFSGLMQPYEE VYA IAVWTNLTEARVRVWFKNRRAKWRKRERNQQMDLCKNGYVPQFSGLMQPYEDI

iavwtnltEIPrvrvwfknrrakwrkrernqQLdlcKGGyvpqfsgLÍVqpyeDVy^

1

(б) Гомология, %

1 2 3 4 5 6 7

1 97.2 97.2 92.9 97.2 100.0 93.0 1

2 2.8 100.0 92.9 94.4 97.1 90.1 2

3 2.8 0.0 92.9 94.4 97.1 90.1 3

4 7.5 7.5 7.5 92.9 92.9 88.6 4

5 2.8 5.8 5.8 7.5 ИЩ 97.1 95.8 5

6 0.0 2.9 2.9 7.5 2.9 92.9 6

7 7.4 10.6 10.6 12.4 4.4 7.5 7

1 2 3 4 5 6 7

Pitxl P. waltl Pitx1_X. tropicalis Pitx1_X. laevis Pitxl_D. rerio Pitx1_M. domestica Pitxl G. aculeatus Pitx1_H. sapiens

Рис. 2. а — сравнение аминокислотных последовательностей наиболее консервативного участка генов Р1Х1 позвоночных; рамки обозначают замены аминокислот; б — результаты сравнения аминокислотной последовательности наиболее консервативного участка гена Р1Х1 тритона с аналогичными участками гена Р1Х1 других позвоночных (1—7).

dom-праймеров ("Силекс", Россия). Праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) конструировали с использованием пакета компьютерных программ DNAStar (США) и данных из международной базы NCBI о структуре исследуемых генов (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Праймеры были подобраны к нуклеотидным последовательностям гена Pitxl из 2-го и 3-го экзонов (прямой: 5'-GCCACTTTCCAGCGTAAC-3'; обратный: 5'-CCTGCATACATGTCTTCGTAG-3').

ПЦР проводили на матрице кДНК с использованием набора для амплификации ("Силекс М", Россия) на амплификаторе Eppendorf Mastercycler ("Eppendorf", Германия). Температурный режим реакции: 94°С - 1 мин, 56°С - 1 мин, 72°С - 1 мин, 40 циклов. Продукт ПЦР фракционировали в 1.5%-ном агарозном геле c бромистым этидием ("Amresco", США) и анализировали на УФ-тран-силлюминаторе ("BIO-RAD", США) с помощью программы QuantityOne. Для секвенирования ПЦР-фрагмент элюировали из агарозы с использованием набора для выделения ДНК из агароз-ных гелей MinElute Gel Extraction Kit ("Qiagen", США). Длина нуклеотидной последовательности, полученной после секвенирования, составила 215 п.о. Компьютерный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей проводили с использованием базы данных NCBI BLAST и пакета программ DNASTAR7 ("Lasergene Inc.", США).

Мы впервые идентифицировали ген Pitxl в на-тивной и регенерирующей сетчатке взрослого

тритона P. waltl. Зачаток регенерирующей сетчатки соответствовал стадии начала дифференци-ровки клеток [4]. С использованием праймеров, сконструированных к наиболее консервативным участкам гена Pitxl у близкородственных видов (Danio rerio, Gasterosteus aculeatus, Xenopus laevis, Xenopus tropicalis), был получен ПЦР-фрагмент размером 215 п.о. В результате секвенирования ДНК ПЦР-фрагмента определена его нуклеотид-ная последовательность (рис. 1а). Гомология полученной нуклеотидной последовательности ДНК ПЦР-продукта из сетчатки тритона P. waltl с нуклеотидными последовательностями генов-ор-тологов Pitxl в ряду позвоночных G. aculeatus, D. rerio, Monodelphis domestica, X. laevis, X. tropicalis составила 85.2, 87.1, 87.4, 88.8, 90.2% соответственно (рис. 1б).

Полученная нуклеотидная последовательность была оттранслирована (рис. 2а). Результаты сравнения аминокислотной последовательности участка гена Pitxl тритона с таковы

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком