РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), №. 1 с.
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ИЛ-8-ПРОДУЦИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ И ДИСФУНКЦИИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ С ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИМИ ХИРУРГИЧЕСКИМИ
ОСЛОЖНЕНИЯМИ
© 2007 г. Е.Ю. Синельникова, И.В. Нестерова*, И.Н. Швыдченко, Е.В. Фомичева, С.Г. Петренко
ФГУ "Российский центр функциональной хирургической гастроэнтерологии Федерального агентства по здравоохранению и. социальному развитию", Краснодар, Россия * Институт, иммунофизиологии, Москва, Россия
Известно, что нейтрофильные гранулоциты (НГ) способны синтезировать de nova белки и приобретать новые функциональные свойства в зависимости от локального микроокружения. Некоторые из этих вновь экспрессируемых белков - хемокины и хемокиновые рецепторы имеют чрезвычайно большое значение как в благополучном разрешении воспалительного процесса, так и в его хронизации. Целью настоящей работы явилось определение способности НГ продуцировать ИЛ-8 при одновременной оценке их функциональной активности у пациентов с гнойно-септическими хирургическими осложнениями. Комплексное исследование НГ, изолированных из периферической крови пациентов обеих групп, выявило наличие дефектов в их функционировании, связанные с депрессией функциональной активности на фоне активации рецепторного аппарата и повышенной спонтанной активности мембранных оксидаз при блокаде этой активности в нагрузочных тестах in vitro с опсонизированным зимозаном у пациентов с панкреонекрозами. При анализе ИЛ-8-продуцирующей активности НГ, в зависимости от тяжести патологического процесса, связанной с его системным или локальным характером, нами были выявлены различия как в уровне спонтанной продукции хемокина нейтрофилами, так и в характере их реагирования на ЛПС, что, возможно, обусловлено различным исходным функциональным состоянием клеток, зависящим от цитокинового профиля сыворотки крови. Ключевые слова: нейтрофильные гранулоциты, дисфункции, интерлейкин-8, липополиса-харид, секреция цитокинов.
Нейтрофильные гранулоциты (НГ) в дополнение к своей традиционной и хорошо изученной роли "профессиональных" фагоцитов способны синтезировать de nova белки и приобретать новые функциональные свойства в зависимости от локального микроокружения. Некоторые из этих вновь экспрессируемых белков — хемокины и хемокиновые рецепторы имеют чрезвычайно большое значение как в благополучном разрешении воспалительного процесса, так и в его хронизации [12, 33].
Интерлейкин-8 (ИЛ-8) принадлежит к СХС-семейству хемокинов и является ключевым эффектором нейтрофильного рекрутирования и активации при остром воспалении
Адрес: 350089, г. Краснодар, проспект Чекистов, 7/2, кв. 58. Тел. (861)2614481. e-mail: sinelnikows@rambler.ru.
[17]. Нестимулированные НГ периферической крови человека экспрессируют относительно высокие уровни рецепторов к ИЛ-8 — СХСИ1 и СХСИ2 [16]. На стимуляцию ИЛ-8 НГ реагируют усиленным хемотаксисом [20], повышенной адгезией к эндотелию и белкам субэндотелиального матрикса [10, 13, 40], де-грануляцией, активацией фагоцитоза, продукцией супероксидрадикалов [3, 14], супрессией апоптоза [22]. ИЛ-8 способен супресси-ровать экспрессию собственных рецепторов [32].
НГ являются важной интегративной точкой для различных сигналов микроокружения, которые могут позитивно или негативно регулировать продукцию хемокинов самими НГ. Эти клетки сами являются мощными продуцентами ИЛ-8, что в результате приводит к быстрой амплификации острого воспалительного процесса двумя различными механизмами: 1) до-
400 350 300 250 200 150 100 50 0
385.6
342,1
7 71
268,3* 7—71
142,3
181,9
131,6
Контроль I II
□ Спонтанная ■ ЛПС-индуцированная
Рис. 1. Особенности фенотипа и функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при гнойно-септических хирургических осложнениях.
полнительным рекрутированием большого количества других НГ и 2) предотвращением в них апоптоза [12].
Индукторами синтеза и секреции ИЛ-8 нейтрофилами являются бактерии и компоненты их клеточных стенок [25, 31, 30, 45], хе-мотаксические пептиды, такие как fMLP [11], C3a и C5a [38], провоспалительные цитокины ИЛ-1р и ФНОа [35], ИЛ-12 [6, 15], ИЛ-15 [29], ИЛ-18 [24], ГМ-КСФ и ИЛ-3 [23, 28], а также процессы хемотаксиса и фагоцитоза [7, 34]. Ингибирующий эффект на продукцию ИЛ-8 активированными нейтрофилами оказывают ИЛ-10, ИЛ-4, IL-13, TGFp, простагландин Е2 (ПГЕ2) и дексаметазон [21, 26, 39].
Вследствие своего преобладающего количества на ранних стадиях острого воспаления, НГ являются идеально приспособленными для влияния на последующую лейкоцитарную миграцию и природу воспалительного процесса. Участие НГ в цитокиновой сети может являться конститутивным связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунным ответом [43]. ИЛ-8, продуцируемый НГ, ауто/паракринно стимулирует высвобождение Р-дефенсинов нейтрофила-ми, которые действуют как хемоаттрактанты для незрелых дендритных клеток и наивных Т-лимфоцитов через связывание с хемокино-вым рецептором CCR6 [37, 44]. НГ, стимулированные ИЛ-8, высвобождают также растворимый рецептор к ИЛ-6 (sIL-6R), являющийся важным модулятором лейкоцитарного рекрутирования [42].
В экспериментах in vitro показано, что при увеличении плотности НГ супрессируется секреция ими ИЛ-8. В этот ауторегуляторный
механизм, действующий по принципу обратной связи, вовлечены ИЛ-1га и растворимый рецептор к ФНОа (вТ^И), конкурируя с ИЛ-1- и ФНОа-зависимой генерацией ИЛ-8 [18]. Таким образом, локальное действие ИЛ-8 и других СХС-хемокинов на пришедшие в очаг воспаления НГ может вести к ингибирова-нию ими дальнейшей продукции ИЛ-8, а также обуславливать высвобождение СС-хемо-кинов, что делает эти клетки важными игроками в хемокиновой сети [5, 12].
Так как острый воспалительный ответ является как протективным, так и потенциально опасным для окружающих тканей, лучшее понимание взаимоотношений НГ и ИЛ-8, лежащих в основе нейтрофильного рекрутирования, активации и последующих лейкоцитарных замещений, будет способствовать развитию новых терапевтических подходов, в лечении как инфекционных заболеваний, так и патофизиологического воспаления.
Ранее нами было показана зависимость продукции ИЛ-8 нейтрофилами периферической крови от концентрации бактериального липополисахарида (ЛПС) [4] и влияние на нее пептидных иммуномодуляторов [1].
Целью настоящей работы явилось определение способности НГ продуцировать ИЛ-8 при одновременной оценке их функциональной активности у пациентов с гнойно-септическими хирургическими осложнениями.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследований являлась периферическая венозная кровь 7 пациентов с острым деструктивным панкреатитом (ОДП) — панкреонекрозом, осложненным тяжелой инфекционно-воспалительной системной реакцией (тяжелое течение), и 7 пациентов с абсцессами брюшной полости (более легкое течение) в возрасте от 20 до 50 лет. Диагноз устанавливался на основании клинико-лабо-раторных проявлений и ультразвукового исследования. Забор крови проводился у пациентов с ОДП в фазе развития гнойных осложнений; у пациентов с абсцессами — при их поступлении в стационар до начала традиционной терапии. Контрольную группу составили 27 здоровых добровольцев той же возрастной категории.
НГ выделяли из периферической крови, стабилизированной ЭДТА (2,7%) с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла-верографина (1.077 : 1.093) [9]. Оценивали морфологически чистоту клеточ-
ной взвеси (97 — 98%) и жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим. В концентрации 106 кл/мл НГ культивировали в полной культуральной среде RPMI 1640 ("DIFCO", США) в 5% СО2, при 37 °С, 20 ч с физиологическим раствором (спонтанная секреция) и ЛПС (E. coli:055:B5, "DIFCO", США) в конечной концентрации 10 нг/мл (ЛПС-индуцированная секреция).
Концентрацию цитокина ИЛ-8 в суперна-танте определяли методом твердофазного им-муноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем (ООО "Цитокин", С-Петербург, Россия). Чувствительность метода для ИЛ-8 — 20 пг/мл.
Одновременно тестировали фенотип и функциональное состояние НГ [И.В. Нестерова и др., 1996]. Рецепторный аппарат НГ исследовался непрямым иммунофлюорес-центным методом с помощью панели моно-клональных антител: анти-СБ11Ь, -CD95, -CD16 ("Сорбент", Москва). Фагоцитарную активность НГ исследовали микроскопически по интенсивности захвата частиц опсо-низированного зимозана (3 мкг/мл). Состояние оксидазной микробицидной системы НГ определяли по показателям NBT-теста, подсчитывая клетки с восстановленным форма-заном (% формазан -позитивных клеток, % ФПК). Для оценки степени дополнительной стимуляции внутриклеточного кислородза-висимого метаболизма использовался функциональный нагрузочный тест in vitro c зи-мозаном — стимулированный NBT-тест. По результатам двух тестов расчитывался коэффициент мобилизации — КМ = % ФПК в стимулированном NBT-тесте / % ФПК спонтанном NBT-тесте.
Статистическая обработка результатов проведена с использованием описательной статистики, непараметрического критерия Манна-Уитни и критерия Стьюдента с поправкой Бонферроне для множественных сравнений. Данные представлены в виде среднего арифметического значения (М) и ошибки средней (± m), а также медианы, минимума и максимума для уровня ИЛ-8. Различия считали достоверными при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Комплексное исследование НГ, изолированных из периферической крови пациентов обеих групп, выявило наличие различных клеточных дисфункций (Рис. 1). При тестировании экспрессии поверхностных рецепто-
ров НГ пациентов I группы (панкреонекроз) было обнаружено повышенное как относительное (в 1.4—1.7 раза), так и абсолютное (в 3.4 — 4.1 раза, р < 0.001) содержание CD11b-, CD16-, CD95-позитивных клеток относительно здорового контроля. У пациентов с абсцессами брюшной полости (группа II) активация рецепторного аппарата была менее выраженной, но, тем не менее, абсолютное количество CD11b + -, CD16+-, CD95+-OT было существенным (в 2.5 раза выше, чем в контроле, р < 0.01), вследствие выраженного нейтрофиле-за. Активация рецепторного аппарата при ГСО сопровождала
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.