РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 1, с. 56-62
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ИММУНИЗАЦИЯ НЕТОКСИЧНЫМИ ВАРИАНТАМИ ШИГА ТОКСИНА 2-ГО ТИПА
© 2015 г. Е.В. Лукьянов, Л.Г. Захарова, О.С. Хасанова, Ф.К. Хасанов, Ю.В. Козлов
Институт молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН,
Москва, Россия
Поступила: 01.10.2014. Принята: 15.01.2015
Шига токсины продуцируются некоторыми болезнетворными штаммами кишечной палочки Escherichia coli и являются основными факторами вирулентности. Особенно тяжёлые последствия связаны с интоксикацией шига токсином второго типа. Для профилактики заболевания наиболее эффективным подходом представляется превентивная иммунизация генетически инактивированными вариантами токсина, максимально сохраняющими нативную структуру белка. Полученные мутанты с двойными точечными заменами аминокислотных остатков в каталитическом центре, обладающие резко сниженной цитотоксич-ностью, были использованы для иммунизации кроликов. В результате процедуры в крови животных был генерирован высокий титр специфических антител, защищающих чувствительные клетки от интоксикации in vitro, а сами животные бессимптомно переносили инъекции сверхлетальных доз токсина.
Ключевые слова: нетоксичные варианты шига токсина 2-го типа, иммунизация, мутагенез
ВВЕДЕНИЕ
Шига токсины (Stx) составляют семейство функционально и иммунологически различающихся мультимерных белков, которые продуцируются патогенными штаммами STEC кишечной палочки Escherichia coli (от Shiga Toxin producing E. Coli), Shigella dysenteriae и другими бактериями. В составе холотоксина Stx энзиматически-активная субъединица StxA нековалентно ассоциирована с пятью субъединицами StxB, ответственными за связывание со специфическими рецепторами на поверхности некоторых эукариотических клеток [1]. После связывания холотоксин поглощается посредством клатрин-зависимого эндоцитоза и транспортируется по ретроградному пути через комплекс Гольджи в эндо-плазматический ретикулум (ER). После про-цессинга в ER субъединица StxA переносится в цитоплазму и инактивирует рибосомы, что приводит к гибели клетки [2].
Адрес: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д.32, ИМБ РАН,
Козлову Юрию Васильевичу.
E-mail: kozlov@eimb.ru, loukiaev@eimb.ru
При заражении человека и животных штаммами БТБС токсин высвобождается в полость кишечника и поражает сначала слизистую оболочку, а затем всасывается в кровь и разносится по всему организму. Это вызывает у человека водную диарею, которая часто сопровождается тяжёлым осложнением — геморрагическим колитом [3]. В 5—10% случаев осложнение прогрессирует далее и развивается в смертельно опасное системное заболевание — гемолитический уремический синдром [4]. Таким образом, шига токсины являются основными факторами вирулентности.
В настоящее время эпидемии, вызванные штаммами БТБС, отмечены уже в более чем трёх десятках стран шести континентов и наносят огромный материальный ущерб [5]. Все антимикробные агенты оказались малоэффективными для борьбы с эпидемиями, так как штаммы БТБС приобрели множественную лекарственную устойчивость [6]. Весьма перспективными для терапии интоксикации представляются иммунологические подходы, поскольку: 1) специфические антитела являются единственными известными агентами,
способными непосредственно нейтрализовать эти токсины; 2) Stx являются хорошей антигенной мишенью для специфических антител, так как значительно отличаются по структуре от аутоантигенов, экспрессируе-мых клетками человека и домашних животных [7].
При эпидемиях, вызванных STEC, наиболее тяжёлые последствия ассоциированы с продукцией бактериями шига токсина 2-го типа Stx2 [8]. В настоящей работе получены нетоксичные варианты холотоксина Stx2. Иммунизация животных синтезированными белками проходит бессимптомно и индуцирует высокий уровень продукции специфических антител, обладающих выраженным защищающим действием против интоксикации шига токсином второго типа.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Получение вариантов рекомбинантного холотоксина
Фрагмент ДНК, несущий кодирующую часть оперона stx2, был амплифицирован с помощью ПЦР на матрице хромосомной ДНК E. coli O157:H7 #37 и клонирован в вектор pCRII с помощью набора TA Cloning Kit (Invitrogen). Нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента полностью совпадала с таковой кодирующей части классического оперона stx2a [9]. Точечные замены аминокислотных остатков в субъединице Stx2A осуществляли посредством введения нуклеотидных замен в кодирующую часть гена stx2A с помощью ПЦР мутагенеза [10]. Проведённый мутагенез обеспечивал замены Tyr77->Glu и Tyr114->Leu в варианте Stx2[Y77E/Y114L], Glu167->Asp и Arg170->His в варианте Stx2[E167D/R170H], Glu167->Gln и Arg170->His в варианте Stx2[E167Q/ R170H]. После верификации нуклеотидной последовательности фрагменты ДНК, несущие модифицированные гены шига токсина, субклонировали в экспрессионный вектор pET22b( + ), и полученными плазмидами трансформировали клетки E. coli BL21(DE3) (Novagen).
Для оптимизации условий экспрессии свежие ночные культуры разводили 1: 25 и подращивали в бульоне Луриа, содержащем 150 мкг/мл ампициллина, в течение двух часов при 37° С. Экспрессию рекомбинантных белков индуцировали, добавляя IPTG до ко-
нечной концентрации 10, 20, 50 или 100 мкМ, клетки подращивали при 30° С, и через разные интервалы времени отбирали аликвоты по 4 мл. Клетки осаждали центрифугированием и суспендировали в 1 мл р-ра: 30 мМ трис-HCl, pH8,0, 20% сахароза, 2 мМ ЭДТА. После выдерживания на льду в течение 1 ч клетки вновь осаждали и ресуспендировали в 100 мкл 5 мМ MgCl2. Суспензию выдерживали на льду в течение ночи, клетки осаждали, а супернатант использовали в качестве периплазматического экстракта. Образцы периплазматического экстракта разделяли с помощью денатурирующего электрофореза в 15% SDS ПААГ, после чего гели окрашивали Coomassie R-250. Уровень экспрессии вариантов токсина оценивали по интенсивности окрашивания полос, соответствующих по молекулярному весу полипептидам Stx2A (32 кДа) и Stx2B (7,5 кДа).
Для выделения вариантов холотоксина Stx2 использовали хроматографию на смоле Globotriose Fractogel (IsoSep AB, Швеция), согласно рекоментациям фирмы-производителя [11].
Определение цитотоксичности вариантов Stx2 на культуре клеток
Клетки Vero выращивали в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone), пенициллина (100 ед/мл) (Sigma) и стрептомицина (100 мкг/мл) (Sigma). В экспериментах клетки высевали на 96-луночный планшет с плотностью 2*104 клеток на лунку в 100 мкл среды и растили в течение 24 часов при 37° С в атмосфере 5% СО2. Затем добавляли различные количества полученных вариантов токсина в объёме 2 мкл, в качестве контроля использовали разведения Stx2 дикого типа. Клетки инкубировали ещё 48 часов, а затем окрашивали кристаллвиоле-том. Цитотоксическое действие определяли по соотношению живых и мёртвых клеток, измеряя степень включения красителя в живые клетки по поглощению при длине волны 620 нм.
В экспериментах по определению защитного действия генерируемых антител 10 мкл разных разведений сыворотки (0, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20) инкубировали с 2 нг токсина Stx2 дикого типа в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего образцы добавляли к клеткам Vero и проводили тест на цитоток-сичность.
Иммунизация кроликов и определение её защищающего действия
Иммунизацию кроликов проводили малотоксичными вариантами Stx2[E167D/R170H] и Stx2[E167Q/R170H] по стандартной методике [12]. Кроликам подкожно вводилось по 1 мг рекомбинантного белка в смеси с адъюван-том, спустя три недели проводили повторную инъекцию, а ещё через две недели — третью. Через две недели из ушной вены отбирали кровь и получали сыворотку. При определении защитного действия генерируемых антител иммунизированым животным вводили в ушную вену Stx2 дикого типа в количестве 1 мг на 1 кг живого веса.
Иммунодиффузия в агарозном геле
Для двойной радиальной диффузии по Ухтерлони использовали 1% агарозный гель, приготовленный на PBS. В качестве антигена в лунки вносили 10 мкг Stx2 или 10 мкг Stx1 (контроль) в PBS, а также 1: 2, 1: 5 и 1: 10 разведения сыворотки, полученной из кроликов №№ 1 — 3. Иммунопреципитацию проводили в течение ночи при 37 °С.
Вестерн-блот анализ
2 и 4 нг Stx2 разделяли посредством электрофореза в 15% SDS ПААГ, на контрольные дорожки наносили 4 нг Stx1. Белки переносили на PVDF мембрану Immobilon-P (Millipore), дальнейшие манипуляции проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Первичные поликлональные антитела получали посредством осаждения сульфатом аммония из сыворотки иммунизированных животных № 1 — 3 с последующим диализом образцов против нескольких смен PBS [12]. Использовали 1:1000, 1:5000 и 1:20000 разведения. В качестве вторичных антител использовали конъюгат пероксидазы с ослиными антителами против иммуноглобулина IgG кролика (Amersham Biosciences), разведения 1:2000 и 1:10000. Детекцию проводили с помощью набора ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences). После отмывки мембраны экспонировали в течение 4, 20 сек или 2 мин с рентгеновской плёнкой (Santa Cruz Biotechnology).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Получение и анализ вариантов Stx2
Для синтеза рекомбинантного Stx2 и его вариантов нами была использована экспресси-
онная система из штамма-продуцента E. coli BL21(DE3) и вектора pET22b( + ) (Novagen). Сочетание низкого уровня индукции (10 мкМ IPTG), пониженной температуры инкубации (30 °C) и относительно короткого времени выращивания бактерий после начала индукции (4 часа) позволило минимизировать интоксикацию клеток бактерии-хозяина и обеспечило наиболее высокий суммарный уровень продукции токсина (конечный выход составил более 1 мг холотоксина из 1 л индуцированной культуры E. coli). Мутантные варианты токсина несли точечные замены двух аминокислотных остатков в субъединице Stx2A (рис. 1А), что минимизировало изменения структуры белка.
Цитотоксичность полученных вариантов Stx2 определяли на клетках Vero, несущих на поверхности большое количество специфического рецептора Gb3/CD77 и чувствительных к д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.