научная статья по теме ИММУНИЗАЦИЯ НЕТОКСИЧНЫМИ ВАРИАНТАМИ ШИГА-ТОКСИНА 2-ГО ТИПА STX2 ГЕНЕРИРУЕТ ВЫСОКИЙ ТИТР ЗАЩИЩАЮЩИХ АНТИТЕЛ Математика

Текст научной статьи на тему «ИММУНИЗАЦИЯ НЕТОКСИЧНЫМИ ВАРИАНТАМИ ШИГА-ТОКСИНА 2-ГО ТИПА STX2 ГЕНЕРИРУЕТ ВЫСОКИЙ ТИТР ЗАЩИЩАЮЩИХ АНТИТЕЛ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 460, № 3, с. 349-351

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 576.8.097.29:577.113.5.214

ИММУНИЗАЦИЯ НЕТОКСИЧНЫМИ ВАРИАНТАМИ ШИГА-ТОКСИНА 2-ГО ТИПА Stx2 ГЕНЕРИРУЕТ ВЫСОКИЙ ТИТР

ЗАЩИЩАЮЩИХ АНТИТЕЛ

© 2015 г. Е. В. Лукьянов, Л. Г. Захарова, О. С. Хасанова, Ф. К. Хасанов, Ю. В. Козлов

Представлено академиком РАН А. А. Макаровым 18.07.2014 г. Поступило 18.07.2014 г.

БО1: 10.7868/80869565215030263

Эффективная терапия интоксикаций, вызываемых действием шига-токсина 2-го типа Stx2, в настоящее время отсутствует. Наиболее перспективным подходом для профилактики представляется превентивная иммунизация против Stx2, а для терапии острых случаев предпочтительно применение защищающих антител. В настоящей работе получены нетоксичные варианты Stx2, иммунизация которыми проходит для подопытных животных бессимптомно и генерирует высокий титр специфических антител, защищающих от действия токсина.

Заражение человека и животных штаммами Escherichia coli STEC вызывает водную диарею, которая часто сопровождается тяжелыми осложнениями — геморрагическим колитом и гемолитическим уремическим синдромом [1].

Периодически повторяющиеся эпидемии наносят огромный экономический ущерб, который только в США оценивается в 1 млрд долларов ежегодно [2]. Типичным примером служит недавняя вспышка в Германии [3]. Основные патологические симптомы обусловлены действием продуцируемых бактериями шига-токсинов (Stx), причем наиболее тяжелые последствия ассоциированы с токсином 2-го типа Stx2 [4]. В настоящее время единственными известными агентами, способными нейтрализовать токсины Stx, являются специфические антитела [5]. Для генерирования защищающих антител наиболее эффективным является использование для вакцинации неактивных вариантов токсина, одновременно сохраняющих максимальное число иммуногенных эпитопов, характерных для биологически активной формы. Мы получили (табл. 1) варианты Stx2, несущие

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской Академии наук, Москва

точечные замены одного или двух ключевых аминокислотных остатков Tyr77, Tyr114, Asp167 или Arg170 предполагаемого каталитического центра [6, 7]. Для синтеза была использована экспресси-онная система из штамма-продуцента E. coli BL21(DE3) и вектора pET22b(+) ("Novagen", США). Гены stx2 клонировали из E. coli O157:H7 #37 [8], а точечные замены аминокислотных остатков в субъединице Stx2A осуществляли посредством введения нуклеотидных замен в кодирующую часть гена stx2A с помощью ПЦР-мутаге-неза [9]. Белки выделяли в соответствии с методикой, описанной в работе [10].

Цитотоксичность полученных вариантов Stx2 для клеток линии Vero, несущих на поверхности большое количество токсинспецифических рецепторов Gb3/CD77, определяли по стандартной методике по степени включения в живые клетки красителя кристаллвиолета. Варианты Stx2[Y77E] и Stx2[Y114L], несущие одинарные замены аминокислотных остатков каталитического центра, обнаружили существенное снижение цитоток-сичности (рис. 1а), а для вариантов с двойными заменами Stx2[Y77E/Y114L], Stx2[E167D/R170H] и Stx2[E167Q/R170H] это снижение было еще более значительным (рис. 1а, б).

Такие варианты с резкой, более чем в 106 раз, пониженной цитотоксичностью (табл. 1) являются привлекательными для иммунизации животных. Ранее было показано, что введение кроликам Stx2 дикого типа вызывает развитие диареи, повышение температуры, учащение пульса, судороги и паралич [11]. Степень тяжести симптомов напрямую зависит от количества введенного токсина, и после введения 30—50 мкг/кг неизбежно погибают все животные (LD100 = 30—50 мкг/кг). В целях индукции высокого титра специфических антител мы вводили кроликам малотоксичный вариант Stx2[E167D/R170H] в количестве 1 мг на 1 кг массы тела, что примерно в 30 раз пре-

350 ЛУКЬЯНОБ и др.

Таблица 1. Цитотоксическое действие мутантных вариантов Stx2 на клетки линии Vero

Барианты холотоксина Stx2 Замены аминокислотных остатков в каталитическом центре Stx2A CD50 Снижение токсичности, (раз)

[Y77E] Tyr77 — Glu 270-320 нг/мл 104

[Y114L] Tyr114 —- Leu 10-20 нг/мл 1.5 X 103

[Y77E/Y114L] Tyr77 —- Glu, Tyr114 — Leu 20-30 мкг/мл 106

[E167D/R170H] Glu167 —» Asp, Arg170 —- His 35 мкг/мл 1.2 X 106

[E167Q/R170H] Glu167 — Gln, Arg170 —>- His >100 мкг/мл >3 X 106

Дикий тип - 25-30 пг/мл 1

0050 — концентрация токсина, вызывающая гибель 50% клеток после 48 ч инкубации.

вышало количество, допустимое при использовании химически модифицированных токсоидов (30 мкг/кг) [12]. Хотя данное количество соответ-

Быживаемость клеток, % 100«

90

80

70

60

50

Stx2

Y77E

Y114L

[Y77E/Y114L

40 -

30 -

20 -

10 - (a)

0 1 1

1E-04 0.01

0.001

100

90 - \

80 - Л

70 - \

60 - 1

50 -

40 -

30 -

20 -

10 - (б)

0 1 1

0.0001 0.01

100 10000 10 1000 1E+05

1 100 10000 0.001 0.1 10 1000 100000 Концентрация токсина, нг/мл

Рис. 1. Малотоксичные варианты 81x2. (а) — цитотоксическое действие на клетки \fero мутантных вариантов с точечными заменами аминокислотных остатков субъединицы 81х2А в участке, ответственном за связывание аденинового кольца остатка А4324 288 РНК эукариотических рибосом; (б) — цитотоксическое действие на клетки линии \fero мутантных вариантов с точечными заменами аминокислотных остатков субъединицы 81х2А в участке, ответственном за про-тонирование аденинового кольца остатка А4324.

ствовало 20—30 летальным дозам Stx2 дикого типа, за все время наблюдений все инъецированные нами животные не обнаружили каких-либо отклонений от нормы, т.е. использованный белок не оказывал токсического действия. Сыворотка крови иммунизированных животных давала интенсивные полосы преципитации с антигеном Stx2, а ее использование в Вестерн-блот-анализе в качестве первичных антител выявляло специфические полосы, соответствующие Stx2A и Stx2B (но не StxlA и StxlB в контроле), даже при высоких (1 : 20000) разведениях. В экспериментах на цитотоксичность действие Stx2 на клетки Vero было полностью нейтрализовано, если токсин предварительно инкубировали с образцами сыворотки.

Для оценки защищающего эффекта иммунизации на экспериментальных моделях был проведен следующий опыт. Кроликам трижды вводили 1 мг Stx2[E167D/R170H] на 1 кг массы тела по стандартной методике. Через неделю после последней инъекции иммунизированным и контрольным животным вводили в ушную вену Stx2 дикого типа в дозе 1 мг/кг, что составляет примерно 20—30 летальных доз [11]. Хотя контрольные животные погибли в течение первых трех суток после инъекции, у всех иммунизированных животных мы не выявили никаких симптомов, обусловленных действием токсина (табл. 2). И впоследствии по всем признакам они сохраняли нормальную жизнедеятельность.

Иммунные препараты против Stx2 находятся только в стадии разработки, хотя данные экспериментов носят обнадеживающий характер [13]. В настоящей работе получены варианты Stx2, обладающие крайне низким цитотоксическим действием. Их высокие иммуногенные свойства и отсутствие патогенного действия in vivo позволяют генерировать в крови иммунизируемых животных высокий титр специфических защищающих антител. Это открывает возможность использования этих вариантов для иммунизации сельскохозяйственных животных против STEC-инфекций, а также, возможно, и для непосредственной вакцинации человека против геморрагического колита и гемолитического уремического синдрома.

1

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 460 № 3

2015

ИММУНИЗАЦИЯ НЕТОКСИЧНЫМИ ВАРИАНТАМИ 351

Таблица 2. Защищающий эффект иммунизации кроликов малотоксичным вариантом 81х2[Б167В/К170Н] против действия 81x2 дикого типа

Количество Иммунизация: Погибло после инъекции Выживае-

испытуемых животных троекратно вводили подкожно 1 мг|кг Stx2 мость, %

4 Адъювант (контроль) 4|4 0

6 Адъювант с Stx2[E167D|R170H] 0|6 100

Нетоксичные варианты Stx2 представляются эффективными для разработки и производства диагностических и терапевтических антител. Практическому применению способствует достигнутый высокий выход рекомбинантных белков.

Работа была выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10—04—00861).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gyles C.L./I J. Anim. Sci. 2007. V. 85. P. E45-E62.

2. Buzby J.C., Roberts T., Lin C.-T.J., et al. || Agricul. Econ. Rep. 1996. № 741. P. 21-29.

3. Hebbelstrup Jensen B., Olsen K.E., Struve C., et al. || Clin. Microbiol. Rev. 2014. V. 27. P. 614-630.

4. Yoon J.W., Hovde C.J. || J. Vet. Sci. 2008. V. 9. № 3. P. 219-231.

5. Chames P., Van Regenmortel M., Weiss E., Baty D. // Brit. J. Pharmacol. 2009. V. 157. P. 220-233.

6. Ho M.C., Sturm M.B., Almo S.C., et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 20276-20281.

7. Fraser M.E., Chernaia M.M., Kozlov Y.V., et al. // Nat. Struct. Biol. 1994. V. 1. P. 59-64.

8. Scheutz F, TeelL.D., Beutin L., et al. // J. Clin. Microbiol. 2012. V 50. P. 2951-2963.

9. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., et al. // Gene. 1989. V. 77. P. 51-59.

10. Ishikawa S., Kawahara K, Kagami Y, et al. // Infect. Immun. 2003. V. 71. P. 3235-3239.

11. Richardson S.E., Rotman T.A., Jay V., et al. // Infect. Immun. 1992. V. 60. P. 4154-4167.

12. Bielaszewska M., Clarke I., Karmali M.A., et al. // Infect. Immunol. 1997. V. 65. P. 2509-2516.

13. ChowS.-K, CasadevallA. // Toxins. 2012. V 4. P. 430454.

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 460 № 3 2015

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком