ш
УДК 577.112.6.083.3
ИММУНИЗАЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКИМ ФРАГМЕНТОМ РЕЦЕПТОРА НЕЙРОТРОФИНОВ р75 ПРЕДОТВРАЩАЕТ ПОТЕРЮ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ПАМЯТИ И СНИЖАЕТ УРОВЕНЬ БЕТА-АМИЛОИДА У МЫШЕЙ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ИНДУЦИРОВАННОЙ ФОРМОЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
© 2014 г. О. М. Вольпина*, Н. И. Медвинская**, А. В. Камынина*, #, Я. В. Запорожская*, И. Ю. Александрова**, Д. О. Короев*, А. Н. Самохин**, Т. Д. Волкова*, А. С. Арсеньев*, Н. В. Бобкова**
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
**Институт Биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, ул. Институтская, 3 Поступила в редакцию 11.12.2013 г. Принята к печати 09.01.2014
В патогенезе болезни Альцгеймера центральную роль играет бета-амилоидный пептид, нейроток-сическое действие которого обусловлено взаимодействием с рядом рецепторов, локализованных на поверхности нервных клеток. Одной из мишеней бета-амилоида является многофункциональный рецептор нейротрофинов р75, в норме ответственный за поддержание баланса выживающих и погибающих клеток мозга, особенно ацетилхолинсинтезирующих нейронов базальных ядер переднего мозга. Мы предположили, что стимуляция продукции антител, направленных к потенциальным участкам связывания р75 с бета-амилоидом, может явиться эффективным инструментом для иммунотерапии болезни Альцгеймера, характеризующейся холинергическим дефицитом. Было выбрано четыре потенциально иммуноактивных фрагмента рецептора р75 и осуществлен их синтез. Изучение иммунопротективного действия пептидов, проведенное на мышах с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера, позволило выявить два фрагмента, эффективно предохраняющих пространственную память животных от нарушений. С использованием ИФА гомогена-тов мозга было показано, что только иммунизация фрагментом 155—164 рецептора р75 приводила к существенному снижению уровня бета-амилоида у экспериментальных животных. Таким образом, выявлены два иммуногенных фрагмента рецептора р75, которые могут стать основой для создания новых средств терапии болезни Альцгеймера.
Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, рецептор нейротрофинов р75, бета-амилоид, синтетические пептиды, антитела.
DOI: 10.7868/S0132342314040150
ВВЕДЕНИЕ
Рецептор нейротрофина р75 локализован преимущественно на мембранах ацетилхолинсинтезирующих нейронов мозга и играет ключевую роль в регуляции их синаптической пластичности [1]. Взаимодействуя с нейротрофинами, р75 является
Сокращения: БЭ — бульбэктомированный; ЛО — ложно-оперированный; НАФ — неполный адъювант Фрейнда; ПАФ — полный адъювант Фрейнда; DIEA — Л^Л-диизо-пропилэтиламин; KLH — гемоцианин улитки; PBS — буфер, содержащий 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 7.8 мМ Na2HPO4, 1.5 мМ KH2PO4, pH 7.4; TBTU — тетрафторборат 0-(безнзо-триазол-^ил^Л^Л^Л^Л-тетраметилмочевины.
# Автор для переписки (тел.: +7 (495) 336-57-77; эл. почта: aneskaminina@mail.ru).
также рецептором для целого ряда других лиган-дов и способен образовывать комплексы с широким спектром корецепторов [2]. В ответ на связывание определенного лиганда или корецептора р75 может стимулировать выживаемость нейронов или инициировать каскад реакций, ведущих к апоптозу и к гибели клеток [3]. Показана важная роль рецептора р75 в патогенезе болезни Альцгеймера [4, 5], которая заключается в его связывании с нейротоксическим бета-амилоидом, вызывающим каскад реакций и приводящим к гибели нейронов [6, 7]. Известно, что лиганды белка р75, взаимодействующие с его внеклеточным доменом, блокировали токсическое действие бета-амилоида в тестах in vitro [8]. Специфические ан-
452
BOЛЬПИНA и др.
Таблица 1. Aминокислотные последовательности синтетических пептидов
Пептид Фрагмент Aминокислотная последовательность
(I) 39-47 HSGECCKAG
(II) 96-104 SAPCVEADDG
(III) 155-164 SDEANHVDPCG
(IV) 167-176 CTVCEDTERQG
титела к таким мишеням бета-амилоида, как аце-тилхолиновый рецептор и прионный белок, способны предохранять нейроны от токсического действия бета-амилоида и предотвращать потерю пространственной памяти у животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера [9—11]. Мы предположили, что подобным протективным действием будут обладать антитела к указанным участкам внеклеточного домена рецептора р75. Для стимуляции образования антител, строго направленных к таким участкам белковой цепи, представлялось перспективным использование синтетических пептидов, имеющих ту же аминокислотную последовательность, что и выбранные фрагменты рецептора р75. Данное исследование проводили на модели спорадической формы болезни Альцгеймера — бульбэкто-мированных (БЭ) мышах, развивающих в отдаленные сроки после удаления обонятельных луковиц поведенческие, морфологические и биохимические признаки нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа, включая потерю пространственной памяти, повышение уровня мозгового бета-амилоида, холинергический дефицит и гибель нейронов в структурах, ответственных за обучение и память [12—14].
Таким образом, целью настоящей работы явились выбор в последовательности рецептора р75 участков — потенциальных сайтов связывания бета-амилоида, их синтез и изучение влияния иммунизации соответствующими пептидами на состояние пространственной памяти БЭ-мышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На основе данных рентгеноструктурного анализа комплексов внеклеточного района димера [15] и мономера [16] рецептора р75 с фактором роста нервов были выявлены неструктурированные участки белковой цепи, являющиеся потенциальными сайтами связывания с бета-амилоидом и одновременно потенциальными последовательными В-эпитопами белка. Известно, что синтетические пептиды, моделирующие именно последовательные В-эпитопы белков, способны эффективно стимулировать образование противобелковых антител [17]. Таким образом, неструктурированные
внеклеточные участки рецептора р75 являются потенциальными мишенями для протективных антител, предотвращающих связывание бета-амилоида с рецептором р75.
При выборе фрагментов также учитывали, что в первичных структурах белка р75 человека (P08138 (TNR16_HUMAN) UniProtKB) и мыши (Q9Z0W1.1 (TNR16_MOUSE UniProtKB) имеются участки со 100%-ной гомологией. Именно они и представляют наибольший интерес для исследования, поскольку с большой долей вероятности играют сходную биологическую роль в организмах человека и мыши.
Bсем вышеперечисленным условиям соответствуют четыре фрагмента белка p75: 39-47, 97-105, 155-164 и 167-176. Последовательности синтезированных пептидов, соответстующих выбранным фрагментам, приведены в табл. 1.
Пептиды были синтезированы твердофазным методом на я-алкоксибензильном полимере с использованием Fmoc-производных аминокислот. Для защиты боковых функций остатков Ser и Thr использовали Bu'-группу, для Asp и Glu - OBu'-группу, для Lys - Boc-группу, для Cys - Trt- и для Arg - Pbf-группу. Наращивание полипептидной цепи проводили TBTU-методом. Для оптимизации схемы синтеза в качестве C-концевой аминокислоты всех пептидов использовали остаток глицина. Отщепление пептида от полимера с одновременным удалением защитных групп боковых функций проводили смесью трифторуксусной кислоты с добавками, предотвращающими протекание побочных реакций. Сырые продукты синтеза очищали методом препаративной обращенно-фазовой BЭЖX. BbK^ пептидов составил 5080% в расчете на содержание гидроксильных групп в исходном полимере. Индивидуальность полученных соединений была подтверждена данными аминокислотного анализа, масс-спектро-метрии и аналитической обращенно-фазовой BЭЖX. Степень гомогенности синтетических пептидов по данным аналитической BЭЖX составила более 95%. Bремена удерживания и молекулярные массы полученных соединений приведены в табл. 1.
Bлияние иммунизации синтетическими пептидами на состояние пространственной памяти изучали на БЭ-мышах линии NMRI, которые, согласно литературным данным, являются валидной моделью спорадической формы болезни Aльцгеймера [12, 13]. Для индукции антител мышей дважды иммунизировали конъюгатами пептидов с гемоцианином улитки (KLH). Первую иммунизацию осуществляли до операции буль-бэктомии, а вторую иммунизацию, обеспечивающую индукцию высокого уровня антител, - после операции бульбэктомии. Через 10 дней после второй иммунизации у мышей отбирали кровь для
определения титров противопептидных антител, а затем проводили обучение в водном лабиринте Морриса и тестировали состояние пространственной памяти животных. В качестве контроля использовали ложнооперированных (ЛО) и не-иммунизированных БЭ-животных.
В результате проведенных исследований было показано, что все четыре пептида в виде конъюга-тов с гемоцианином стимулировали продукцию высокого уровня противопептидных антител у мышей данной линии (по 7 мышей в группе) (табл. 2). Титры измеряли индивидуально у каждого животного, в таблице для каждой группы приведен диапазон значений титров специфических антител. Пространственную память животных тестировали, оценивая достоверное превышение времени нахождения мышей в секторе обучения над остальными индифферентными секторами водного лабиринта Морриса. Результаты тестирования показали, что иммунизация пептидами (I) и (II) была неэффективна у большинства подопытных животных (табл. 2). В то же время иммунизация пептидами (III) и (IV) предотвращала ухудшение пространственной памяти у большинства БЭ-мышей (5 из 7 и 6 из 7, соответственно). Все контрольные неиммунизи-рованные БЭ-мыши характеризовались потерей пространственной памяти (ни одно животное не выделяло сектор обучения), в то же время все контрольные ЛО-мыши демонстрировали высокий уровень пространственной памяти и достоверно выделяли отсек обучения.
Далее были проведены детальные исследования состояния пространственной памяти БЭ-мы-шей, иммунизированных пептидами (III) и (IV), проявившими наиболее высокую протективную активность. Состояние пространственной памяти изучали, фиксируя число заходов в каждый сектор водного лабиринта Морриса и время нахождения в нем индивидуально для каждого животного с последующей статистической обработкой данных для каждой группы с использованием фак
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.