ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 478-484
УДК 619.611.573.616:092.632.636.578
ИММУНОФЕРМЕНТНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТОЛБНЯЧНОГО ТОКСИНА И АНАТОКСИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
© 2004 г. М. А. Буркин*, В. В. Свиридов*, О. В. Перелыгина**
*Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН; Москва, 103064;
burma@mail.magelan.ru
**Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича РАМН, Москва, 123022 Поступила в редакцию 25.08.2003 г.
Описано получение моноклональных антител ТТ-1, ТТ-2 и ТТ-3 к столбнячному токсину/анатоксину. Показана возможность использования в качестве иммуногена как коммерческой коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины, так и столбнячного анатоксина, конъюгированного с низкомолекулярным гаптеном. Антитела ТТ-1 и ТТ-2 нейтрализовали столбнячный токсин в тесте in vivo. На основе использования полученных моноклональных антител проведены разработка и сравнение нескольких вариантов количественного определения стобнячных анатоксина и токсина в иммуно-ферментном анализе. Более чувствительный конкурентный ИФА позволял выявлть до 0.01 ЕС/мл анатоксина и до 50 ЬБ50/мл токсина.
Столбнячный токсин (СТ), наряду с ботулини-ческим, является одним из наиболее токсичных соединений. Он продуцируется в анаэробных условиях Clostridium tetani в виде одноцепочечного полипептида с молекулярной массой 150 кДа. В лабораторных условиях токсин, выделяемый из среды культивирования, состоит из двух субъединиц: А (50 кДа) и BC (100 кДа), или легкой (L) и тяжелой (H) цепей, соединенных дисульфидной связью. Споры возбудителя, попав через поврежденную кожу в ткани, превращаются в бациллы, синтезирующие в окружении некротизированной ткани токсин. Фрагмент C токсина, карбокситерминальная часть (~50 кДа) тяжелой цепи, связывается ганглиозидсо-держащим рецептором нервных окончаний, после чего происходит эндоцитоз токсина, его ретроградное распространение по аксонам и накопление в центральной нервной системе. А-фрагмент - фер-ментативно активная часть молекулы - является цинкзависимой протеазой, вызывающей расщепление синаптобревина и тем самым блокаду секреции тормозных медиаторов (глицин и ГАМК) в си-наптическую щель [1]. Такое нарушение проведения нервного импульса приводит к развитию типичного для столбняка спастического паралича.
Иммунитет к столбняку определяется только антителами к токсину. Летальная доза СТ, рассчитанная для человека, составляет менее 2.5 нг/кг. Столь незначительные количества токсина недостаточны для индукции синтеза антител. Поэтому иммунизация - средство как профилактики, так и лечения пациентов с клиническими признаками заболевания - является единственным способом
борьбы со столбняком. Эффективность ее в значительной мере определяется качеством используемых для этого препаратов столбнячного анатоксина (CAT).
Вопрос о протективных свойствах того или иного фрагмента токсина изучается довольно давно. До настоящего момента нет единого мнения о том, какая часть или фрагмент молекулы токсина в первую очередь индуцирует синтез протективных (нейтрализующих) антител и определяет формирование защиты. Были предприняты попытки выявить протективные эпитопы, определяя защитную активность моноклональных антител (MK-AT), направленных к различным участкам молекулы токсина. В табл. 1 приведены данные ряда публикаций, посвященных изучению этой проблемы.
Обращает на себя внимание тот факт, что, несмотря на различия использованных методических приемов при получении гибридом, иммуноге-нов (CAT, фрагменты СТ, комплексы СТ-анти-тела), видовой принадлежности антител, все эти антитела нейтрализовали СТ в тесте in vivo, проявляя при этом специфичность к A-, к B- или к C-фрагментам токсина, а часть протективных MK-AT реагировала с эпитопами, экспрессирован-ными как на A- и B-, так и на A- и C-фрагментах. Кроме того, рядом авторов отмечен защитный эффект смесей MK-AT, не обладающих протектив-ными свойствами по отдельности [2, 4, 8, 12, 13].
Таким образом, не представляется возможным связать токсиннейтрализующую активность ан-
Таблица 1. Специфичность моноклоиальиых антител, нейтрализующих столбнячный токсин in vivo
Происхождение
Специфичность антител к фрагментам CT
антител A B A, B A, C C NH2-HC COOH-HC
Человек 1 [7] 1 [4] 1 [12] 2 [3] 1 [2]
5 [12] 1 [6] 1 [4]
3 [7] 1 [8]
Мышь 1 [8] 1 [10] 4 [5] 3 [5] 6 [8] 4 [8]
1 [10] 2 [8] 1 [10]
1 [11]
Крыса 4 [9]
Всего 8 6 6 1 13 7 4
тител со специфичностью к какому-либо одному участку молекулы столбнячного токсина.
В производстве иммунобиологических препаратов важнейшим моментом является контроль и стандартизация их качественных и количественных параметров. При этом необходимо отметить, что для характеристики токсинов и получаемых из них анатоксинов применяются тесты in vivo и in vitro, отражающие различные их характеристики, не имеющие однозначной взаимозависимости. В частности, активность нативных токсинов оценивается в тестах на животных и измеряется в Dlm, ЛД50. Свойства анатоксинов, также оцениваемые на животных, выражают в единицах связывания (ЕС), отражающих взаимодействие со стандартной антитоксической сывороткой в присутствии токсина. Сама процедура тестирования на животных достаточно продолжительна (4 сут), что не позволяет оперативно контролировать процесс накопления продукта в ходе культивирования продуцента. Из тестов, проводимых in vitro, для характеристики антигенных свойств токсина и анатоксина нередко используют и реакцию флокуляции, выражая активность препаратов в единицах Lf. Подобные тесты не дают представления о чистоте препаратов и количестве содержащихся примесных и балластных компонентов (антигенов микробных клеток, белковых компонентов среды культивирования) [14, 15].
Альтернативным методом количественного определения СТ/САТ может служить иммуно-ферментный анализ (ИФА). Предложен сэндвич-вариант ИФА на основе моноклональных [16] и поликлональных антител [17].
Цель работы - получение МК-АТ к столбнячному токсину/анатоксину, исследование их иммуно-химических и эффекторных свойств и сравнительная оценка нескольких вариантов количественного определения СТ/САТ в ИФА с использованием полученных моноклональных антител.
МЕТОДИКА
В работе использованы ростовая среда RPMI-1640 (R 8005), сыворотка плода коровы (F 2442), добавка к ростовой среде ГАТ (гипоксантин-аминопте-рин-тимидин) (H 0262), о-фенилендиамин (P 1526) и глутамин (G 9273), пероксидазный конъюгат стрептавидина (Стрептавидин-ПХ) (S 5512) фирмы "Sigma" (США), кроличьи анти-изотипические сыворотки фирмы "Bio Rad" (США), бесклеточная коклюшно-дифтерийно-столбнячная (КДС) вакцина "Acel-Imune" (Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company) (США), гель гидроксида алюминия Alu-Gel-S (12261), полиэтиленгликоль 1550 (33132) и диме-тилсульфоксид (20385) фирмы "Serva", N-гидро-ксисукцинимидные эфиры биотина (732494) и ами-нокапронары биотина (1008960) производства "Roche" (Германия), антисыворотка кролика к мышиному IgG, антисыворотка осла к иммуноглобулинам кролика, пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7), БСА и желатин отечественного производства. Препараты столбнячного токсина и анатоксина производства Уфимского ГУП НПО "Иммунопре-парат", откалиброваны и предоставлены ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Антитела были получены в ходе серии экспериментов по созданию панели МК-АТ к антигенам: 1) бесклеточной коклюшно-дифтерийно-столбяч-ной вакцины "Acel-Imune", содержащей 15 Lf/мл дифтерийного анатоксина, 10 Lf/мл столбнячного анатоксина (САТ), а также 6.5 мкг/мл коклюшного анатоксина, 70 мкг/мл филаментозного гемагглю-тинина, 3.2 мкг/мл пертактина и 1.6 мкг/мл агглюти-ногена 2 коклюшного микроба; 2) столбнячному анатоксину, конъюгированному как носитель с низкомолекулярным гаптеном (фумонизин Bx).
"Acel-Imune" вакцину вводили мышам BALB/c внутрибрюшинно в 1 и 3 нед по 0.5 мл и 0.25 мл -на 7 нед. Через 3 дня после последней иммунизации спленоциты гибридизировали с клетками миеломы P3-X63-Ag8.653.
Иммунизация мышей конъюгированным САТ велась в течение 7-10 мес с постепенным снижением дозы конъюгата со 100-50 мкг до 5-1 мкг к концу курса и параллельным увеличением интервала между введениями от 2 нед до 2 мес. В первое введение иммуноген, эмульгированный в 0.5 мл полного адъюванта Фрейнда, вводили подкожно в несколько точек в области спины. При последующих иммунизациях водные растворы конъюгата вводили внутрибрюшинно. На 4 сут после последней инъекции осуществляли слияние иммунных спленоцитов с миеломными клетками линии P3-X63-Ag8.653 в соответствии с описанным ранее методом [18].
Тестирование культуральных жидкостей, определение активности и изучение иммунохимических свойств МК-АТ выполняли в условиях твердофазного ИФА на 96-луночных планшетах "Dynatech" (Германия). Планшеты сенсибилизировали растворами антигена или антител, приготовленными в 0.05 М карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9.5, инкубируя их в течение 16 ч при 4°C. Отмывку лунок проводили 3-5 раз 0.15 М фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0.05% твина 20 (ФСБ-т). Растворы антител или антигена и ферментных конъюгатов готовили в ФСБ-т с 1% БСА, а инкубацию с иммунореагентами проводили в течение 1 ч при 37°C. На завершающей стадии анализа использовали субстратную смесь -0.4 мг/мл о-фенилендиамина в фосфат-цитратном буфере, pH 5.0, содержащем 0.005% H2O2. Реакцию останавливали через 45 мин внесением в каждую лунку 50 мкл 4 М H2SO4. Измерение оптической плотности проводили при 492 нм на фотометре "Dynatech MR 5000" (ФРГ).
При первичном отборе гибридных культур оценивали их способность продуцировать антитела к САТ. Для этого лунки планшета заполняли раствором САТ в концентрации 0.2 ЕС/мл. После инкубации планшеты отмывали и вносили пробы культуральной среды растущих гибридом в разведениях. После отмывки лунки заполняли раствором конъюгата кроличьих антител к мышиному IgG с пероксидазой хрена (АМ-ПХ). Анализ завершали в соответствии с описанным выше. По величине ти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.