РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 1, с. 55-62
— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
иммуноферментный анализ модифицированного катионами металлов
Y-глобулина на низких концентрациях
образцов
© 2008 г. С.Б. Чекнёв, И.Е. Ефремова, Е.А. Денисова,
Е.Н. Юшковец
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия Поступила: 27.12.07 г. Принята: 24.01.08 г.
В работе проведен иммуноферментный анализ человеческого сывороточного у-глобули-на, модифицированного катионами меди и цинка, с использованием низких концентраций определяемого белка и специфических антител против IgG (H + L) человека. Показано, что динамика сорбции модифицированных белков на твердой фазе, чистой или покрытой специфическими антителами, существенно отличается от контрольной. При этом у-глобулин, связавший цинк, обнаруживает тенденцию к насыщению твердой фазы раньше контрольного, в то время как белок, присоединивший медь, заполняет, но не насыщает твердую фазу в примененном диапазоне концентраций. Интенсивность реакции специфических антител с у-глобулином, модифицированным цинком, превышает таковую в контроле. Реакция с белком, трансформированным медью, выражена значительно слабее контрольной. Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях связывания катионов металлов первично трансформируются структуры, локализованные в Fc фрагментах молекул антител. Обсуждаются теоретические и практические аспекты хелатирования катионов меди и цинка белками у-глобулиновой фракции плазмы крови.
Ключевые слова: у-глобулин, металл, анализ, низкие концентрации
ВВЕДЕНИЕ
Сегодня не подлежит сомнению, что метаболизм и гомеостаз меди и цинка служат важнейшими факторами, обеспечивающими поддержание иммунопоэза и иммуногенеза, формирование адекватного иммунного ответа, регуляцию функционирования клеточного и гуморального звеньев иммунитета, баланс стимулирующих и ингибирующих эффектор-ные лимфоциты воздействий, реализацию в полном объеме потенциала естественной резистентности организма [1 — 6].
При этом, будучи относительно непрочно связанными белками и гликопротеинами тканей и биологических жидкостей [7, 8], катионы меди и цинка способны опосредовать взаимодействия между содержащими и хе-латирующими металл биомакромолекулами
Адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 18, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. E-mail: cheknev@riem.ru
[7, 8], в результате чего присоединяющие катионы хелаторы претерпевают выраженные конформационные преобразования [9—12]. Последнее не может не сказываться на динамике и характеристиках их взаимодействий с другими биополимерами или клеточными рецепторами, что, в свою очередь, должно существенным образом изменять межмолекулярные и межклеточные контакты, определяющие запуск конкретных иммунных механизмов [10, 12—14].
Связывание катионов меди и цинка с белками у-глобулиновой фракции плазмы крови оказывается в высокой степени специфичным [15, 16]. В то же время, если цинк в свободной, биологически активной форме в определенных (незначительных) количествах присутствует в нормальной плазме крови [11] и может дополнительно высвобождаться из внутриклеточных хранилищ за счет деграну-ляции тромбоцитов в очагах тканевого повреждения или воспаления [17, 18], то медь, как крайне активный в окислительно-восстано-
вительных реакциях металл, циркулирует лишь в связанном с биополимерами состоянии и может, поэтому, присоединяться макромолекулами только в ходе межмолекулярного обмена [3, 17].
Следовательно, хелатирование белками у-глобулиновой фракции единичных катионов должно рассматриваться в контексте случайных событий [7 — 9] и, значит, не исключено вовлечение в связывание катионов тех поверхностных группировок молекулы, которые участвуют в образовании специфических антигенных детерминант циркулирующих в плазме антител [19, 20]. В результате, эти антигенные детерминанты могут видоизменяться, что, вероятно, будет приводить к изменению антигенной специфичности белков с последующей индукцией выработки антител против собственных, связавших металл у-глобулинов [19, 20].
Ранее нами установлено, что связывание катионов меди и цинка белками у-глобулиновой фракции вызывает существенные кон-формационные преобразования молекулы белка [19 — 21]. Независимо от того, подвергался у-глобулин нагрузке молярным избытком металла или хелатировал катионы эквимолярно, структурные перестройки молекулы, действительно, способствовали изменению спектра экспрессируемых у-глобулином специфических антигенных детерминант за счет их перераспределения между отдельными компартментами глобулы [19 — 21]. Однако, при этом, формирования новой антигенной специфичности белка, которая могла бы индуцировать в организме выработку антител к собственному, модифицированному металлом у-глобулину, не происходило [19 — 21].
В наших предшествующих исследованиях получены косвенные указания на преимущественное вовлечение в связывание металла Fc регионов молекул антител [19 — 21]. К тому же, в соответствии с данными [22], 10-кратный молярный избыток меди не ингиби-ровал антиген-связывающей активности антител (изменения в Fab фрагментах оказывались незначительными), а авторы [23] и наши данные [19 — 21] прямо свидетельствовали о возможности изменения результатов серологического тестирования в результате присоединения определяемым белком (у-глобулином или IgG) катионов металлов из микроокружения (здесь уже, очевидно, речь идет об определяемых в ИФА структурах Fc региона).
Следовательно, в условиях физиологического хелатирования катионов, в первую очередь и в значительно большей степени, изменения конформации молекул антител будут затрагивать не антиген-распознающие центры Fab региона, а структуры Fc фрагмента и его шарнирной области, т.е. участки, ответственные за контакт с мембранными Fc рецепторами, запускающими внутриклеточные сигнальные пути, обеспечивающие реализацию функционального ответа эффекторов иммунитета, несущих на поверхности Fc рецепторы.
Принятая нами ранее схема иммунохими-ческих экспериментов предполагала осуществление прямого и «сэндвич» вариантов ИФА с использованием высоких (максимально возможных по условиям получения образцов) концентраций модифицированного металлом у-глобулина [19 — 21]. Она позволяла получать общую картину происходящих с белком, вследствие связывания металла, антигенных преобразований, но не могла, по понятным причинам, дифференцировать локализацию трансформаций между Fab и Fc регионами молекулы [19 — 21].
Целью настоящего исследования явилась попытка проведения ИФА на низких концентрациях модифицированного медью и цинком у-глобулина. При этом динамика формирования монослоя на чистой или покрытой специфическими антителами твердой фазе могла бы способствовать структурному картированию первичных антигенных преобразований белковой глобулы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение образцов модифицированного металлом у-глобулина
Использовали препарат человеческого сывороточного у-глобулина (ICN) в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,14 — 7,16) с концентрацией белка по навеске 100 мкг/мл. Освобожденные от крупных ассоциатов мембранной фильтрацией (0,45 мкм, Millipore) образцы у-глобулина инкубировали в течение 1 час при 37°С с водным сульфатом меди (Merc) или хлоридом цинка; концентрация металла 0,5 мкг/мл. В качестве контроля использовали образцы у-глобулина, инкубированные в тех же условиях, но без солей указанных металлов.
По истечении срока инкубации образцы белков в объеме 10,0 мл двукратно (с про-
межуточным восстановлением в исходном объеме) подвергали молекулярной ультрафильтрации в ячейках Ultracel-30k (Millipore) в режиме 1700 g, 5 мин, с умеренным охлаждением. По окончании фракционирования супернатанты поднимали из ячеек, доводили до исходного объема 0,15 М раствором NaCl и (как и на всех этапах исследования) анализировали спектрофото-метрически в ультрафиолете, в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм с шагом 10 нм, в полуавтоматическом режиме с использованием дифференцирующего спектрофотометра PU 8730 UV/VIS (Philips).
Определение количества связанного белком металла
Количество связавшегося с у-глобулином металла определяли, исходя из содержания свободных катионов в фильтрате, полученном при ультрацентрифугировании связавших металл белков.
Содержание свободных металлов в фильтрате оценивали с использованием спектро-фотометрии реакций комплексообразования: меди — с диэтилдитиокарбаматом натрия (рН 9,0 — 9,2), длина волны 440 нм; цинка — с о-фенантролином (нейтральный рН), длина волны 226 нм.
Определение концентрации белка и молярных отношений в растворе осуществляли на основании спектрофотометрического исследования при длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 0,7).
Кислотность образцов контролировали с помощью электронного рН-метра-иономера Эксперт-001 (Эконикс-Эксперт).
Согласно произведенным расчетам, полученные и исследованные в работе образцы у-глобулина содержали 10 катионов меди или 15 — цинка на молекулу белка.
Иммунохимическое исследование модифицированных металлом белков в реакциях ИФА
В ИФА использовали меченные пероксида-зой кроличьи антитела против IgG (H + L) человека (Медгамал). В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин (Sigma) — 0,05% раствор в 30 мМ цитратном буфере (pH-5,0), с перекисью водорода (4,0 мкл 30%-ной перекиси на 10 мл раствора). Постановку реакций осуществляли в полистироловых 96-луноч-ных плоскодонных планшетах для ИФА (Мед-полимер). Учет результатов производили с использованием ELISA Processor II (Behring) при длине волны 450 нм.
Постановка прямого варианта ИФА
В прямом варианте ИФА планшеты сенсибилизировали известными концентрациями опытных и контрольных образцов у-глобули-на в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 18 час при комнатной температуре. Места возможного неспецифического связывания антител блокировали раствором, содержавшим бычий сывороточный альбумин (Диа М) и 10%-ный тритон Х-100 (Serva) в PBS. Содержание указанных компонентов на 50 мл PBS составляло 250 мг и 250 мкл, соответственно.
Меченные пероксидазой антитела против IgG (H + L) человека вносили в реакционную смесь в ра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.