COPING WITH NONSPECIFIC INTERACTIONS IN COMPLEX NON-INSTRUMENTAL DIAGNOSTICS
Bochkova M. S., Rayev M. B.
Federal State Institution of Science Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Perm, Russia
Blocking properties of various reagents were analyzed as applied in test-systems to determine antibodies against Bordetella pertussis and tetanus and diphtheria toxoids. Analytic systems have been designed as non-instrumental solid-phase dot-immunoassay using immunosorbents in the form of discs and comb-like fixed strips and carbon conjugate as diagnosticum. Results obtained evidence for possible substantial simplification of nonspecific background elimination when applying nonionogenic detergent Tween-20 that prohibits the nonspecific protein surface sorption on immunosorbent and does not reduce the analytic sensitivity. The procedure characteristics of the process have been determined.
Key words: Blocking reagent, dot-immunoassay, carbon diagnosticum
ИММУНОГЕННОСТЬ БЕЛКОВ, КАПСУЛИРОВАННЫХ В ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА-АЛЬГИНАТА
Каширина Е. И., Решетов П. Д., Алексеева Л. Г., Зубов В. П.,
Свирщевская Е. В.
Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
В данной работе предлагается метод капсуляции белков из клещей домашней пыли (КДП) с целью предотвращения контакта с аллергеном. Показано, что упаковка белков КДП в полимерные наночастицы меняет иммунологические свойства белков, препятствует распознаванию белков В-клетками, но эффективно стимулирует Т-клетки. Таким образом, капсуляция белков в полимерные наночастицы позволяет получать вакцины с контролируемым типом действия.
Ключевые слова: полимерные наночастицы, капсуляция белков, хитозан, альгинат
Введение. Аллергия I типа является одним из самых распространённых заболеваний, значительно ухудшающих качество жизни больных и их семей. Причина аллергии заключается в связывании иммуноглобулинов класса Е (IgE), находящихся на поверхности тучных клеток, с аллергенами, что приводит к выбросу медиаторов воспаления в кровь. Единственным методом патогенетического лечения является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ), основанная на подкожном введении экстрактов полноразмерных аллергенов. Для снижения побочных эффектов АСИТ экстракты вводят курсами
в очень низких, постепенно возрастающих дозах длительно (до нескольких лет). Для повышения эффективности терапии необходимо увеличить вводимую дозу. Для решения этой проблемы мы предлагаем использовать кап-сулированные аллергены. Ранее мы получили рекомбинантные аллергены из клещей домашней пыли (КДП) D. farina Der f 1 и Der f 2 [1], которые в данной работе капсулировали в полимерные наночастицы, полученные на основе хитозана и альгината. Хитозан и альгинат являются биосовместимыми и биодеградируе-мыми природным полиэлектролитами [2]. Хи-тозан растворим только в кислой среде и вы-
падает в осадок в физиологических условиях. В отличие от многих полимеров, используемых с биомедицинскими целями, хитозан имеет много активных группировок, которые можно использовать для пришивки функциональных групп [2]. Из-за наличия активных группировок и заряда хитозан спонтанно формирует комплексы. Введение гидрофобных групп способствует процессу самосборки производных хитозана в наночастицы размером 200-300 нм [3]. Целью данной работы являлось получение производного хитозана, способного к самосборке в наночастицы; кап-суляция в такие наночастицы белков КДП, покрытие частиц пленкой альгината и изучение индукции гуморального и клеточного ответа на капсулированные белки.
Методы
Получение капсулированных белков
В работе использовали хитозан с молекулярной массой 40 кДа и степенью дезацетили-рования 0,94; альгинат натрия с массой 50 кДа (Sigma), карбодиимид (КДИ), янтарный ангидрид (Pierce), N-гидроксисукцинимид (Reanal, Венгрия), лауриновую кислоту (Acros Organics, США). Из хитозана получали сукциноилхито-зан по методике [4], далее получали лаурил-сукцииноил-хитозан (ЛСХ) по методике [5]. Для связывания с белками ЛСХ в водном метаноле активировали карбодиимидом (КДИ) по методике [6]. Для получения ядер наноча-стиц смешивали активированный ЛСХ с белками Der f 1 и Der f 2 (1:1) и диализовали смесь против воды, что приводило в самосборке ЛСХ в наночастицы. Для ряда экспериментов получали с помощью КДИ белки Der f 1 и Der f 2, меченные родамином G (Sigma). Концентрацию включенных белков определяли флюо-рометрически на ридере GloMAX (Promega), используя чистые белки, меченные родамином G, в качестве калибровочного контроля. Итоговые наночастицы, имеющие структуру «ядро-оболочка», получали добавлением к суспензии ядер активированный КДИ альгинат Na, что приводило к формированию наноча-стиц хитозана с белком, покрытых альгинатом. Для анализа общего вида наночастиц использовали конфокальную микроскопию (Nikon, Япония) и наночастицы, меченные родамином G. Частицы наносили в капле на предметное стекло, добавляли полимеризующую среду и накрывали покровным стеклом. Размер наночастиц и заряд определяли с помо-
щью метода динамического светорассеяния на приборе Brookhaven (США).
Анализ иммуногенности капсулированных белков
Мышей линии CBA/CaJ иммунизировали однократно 100 мкл наночастиц внутрибрю-шинно. Мышей забивали через 14 дней и забирали сыворотки крови и селезенки. Анализ формирования антител на белки Der f 1 и Der f 2 оценивали с помощью иммуно-ферментного метода по методике [1]. Клеточный ответ оценивали по пролиферации спленоцитов иммунных мышей. Из суспензии спленоцитов удаляли эритроциты гемолизом. Клетки переводили в культуральную среду, в которую добавляли смесь белков Der f 1 и Der f 2 (1:1). Клетки инкубировали на 24- (500 тыс/лунку) и 96-луноч-ных (200 тыс/лунку) планшетах. Анализ пролиферации на 96-луночных планшетах оценивали на 5 день CellTiter-Blue (Promega) методом. Анализ пролиферации в 24-луночных планшетах оценивали с помощью проточной цитометрии на 3 и 5 день, для чего клетки из 24-луночных культур по 100 мкл переносили в пробирки для цитометра и анализировали количество бласт-ных клеток на приборе FACScan (BD, USA). Мертвые клетки исключали окрашиванием йодистым пропидием.
Результаты
Получение и характеристика капсулированных белков Der f 1 и Der f 2
Для получения производного хитозана, способного к самосборке в наночастицы, в хитозан вводили сукцинильные группы, способствующие формированию гидрофильной поверхности, и лаурильные остатки, формирующие гидрофобное «ядро» наночастиц. Белки КДП вводили в процессе формирования ядер. Характеристика ядер приведена в табл. 1. Поскольку ядра формировали простым смешиванием, то, для большего экранирования аллергенов, использовали дополнительную оболочку, которую формировали методом полиэлектролитного комплексообразования с помощью отрицательно заряженного полимера альгината (АЛГ). В результате смешивания разнозаряд-ных полимером формировались наночастицы с суммарным отрицательным зарядом и большим размером, чем исходные ядра (табл. 1). Концентрацию включенных белков определяли с помощью флуориметра с использованием меченых родамином G белков. Соотношение полимера к белку составило примерно 1:15-1:20.
Индукция гуморального ответа на капсу-лированные белки КДП
Для анализа способности индуцировать антительный ответ мышей иммунизировали смесью белков Der f 1 и Der f 2, ядрами или на-ночастицами. Анализ показал, что при иммунизации ядрами или частицами гуморальный ответ не формируется, тогда как при иммунизации белками формировались IgG антитела (табл. 2). Формирование антител на каждый из белков было независимым. Жирным шрифтом отмечена группа, в которой наблюдался гуморальный ответ.
Анализ клеточного ответа на капсулиро-ванные белки
Пролиферацию оценивали двумя независимыми методами: с помощью нового флуоресцентного красителя CellTiter-Blue, восстанавливаемого живыми клетками (аналог МТТ-метода) и по подсчету доли делящихся клеток методом проточной цитометрии. Данные зависимости доли пролиферирую-
щих клеток от концентрации антигена даны за вычетом доли делящихся клеток в культурах без антигена (табл. 3). Клеточный иммунный ответ, вызванный иммунизацией мышей белками и ядрами, полностью совпал, а при иммунизации наночастицами наблюдается достоверная (р<0.001) стимуляция, связанная, по-видимому, с эффектом альгината. Коэффициент корреляции данных двух методов составил 0,96, что показывает высокую достоверность полученных результатов. Пролиферация регистрировалась как на 3-й, так и на 5 день.
Выводы. Нами впервые получены белки, капсулированные в наночастицы хитозана и альгината. Капсуляция белков кардинально изменила иммунные свойства белков и разделила гуморальный и клеточный ответы, что может широко использоваться для разработки вакцин не только при аллергии, но и для индукции противовирусного ответа, где роль антител вторична.
Таблица 1. Характеристика наночастиц
Диаметр, нм ^-потенциал, мВ Концентрация белков, мкг/мл Концентрация полимеров, мкг/мл
Ядра 80±30 + 12±2 200±50 3000±270
Частицы 200±100 -13±3 180±65 3500±387
Наночастицы представляли собой гомогенную суспензию, не теряющую свои свойства в течение 1 мес.
Таблица 2. Продукция IgG, специфичных к Der f 2/Der f 1 мышами линии СВА, иммунизированных смесью 1:1 белков Der f 1 и Der f 2 (f1+f2), белками в составе наночастиц хитозана (Я) белками в составе наночастиц хитозана, покрытых альгинатом (Я/А) и фосфатным буфером (ФБ). Данные приведены в единицах оптической плотности.
Разведения f1+f2 Я Я/А ФБ f1+f2 Я Я/А ФБ
800 1.11 0.29 0.49 0.17 1.70 0.54 0.27 0.22
1600 0.64 0.16 0.32 0.17 0.99 0.38 0.24 0.16
3200 0.50 0.14 0.17 0.17 0.55 0.20 0.22 0.24
Таблица 3. Пролиферативный ответ спленоцитов мышей, иммунизированных разными конструкциями, методом проточной цитометрии (% пролиферирующих клеток) и включения Се11ТИег-В1ие (относительные единицы включения)
Концентрация, мкг/мл Проточная цитометрия,% CellTiter-Blue тест, отн.ед.
f1+f2 Я Я/А f1+f2 Я Я/А
0 0 0 0 0 0 0
10 8.4 6.2 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.