БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ =
УДК 576.54
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РАЗВИТИЯ СУСПЕНЗИОННЫХ И ТКАНЕВЫХ НЕЙРОТРАНСПЛАНТАТОВ
© 2011 г. К. К. Сухинич, О. В. Подгорный, М. А. Александрова
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: transpl@hotmail.com Поступила в редакцию 25.05.2011 г.
Исследовалось приживление и развитие суспензионных и цельных тканевых аллотрансплантатов из ткани мозга эмбрионов мышей, в клетках которых синтезируется зеленый флуоресцентный белок (GFP). Было показано, что клетки трансгенных по GFP мышей могут использоваться для ней-ротрансплантации. Цельные тканевые и суспензионные трансплантаты способны переживать не менее 30 сут без отторжения в мозге взрослых мышей. Показано, что клетки, синтезирующие GFP, способны дифференцироваться в нейрональном и глиальном направлениях, как в цельных тканевых, так и в суспензионных трансплантатах. Иммуногистохимический анализ позволил выявить ре-ципрокный рост волокон между клетками донора и реципиента и в том, и в другом случае. Исследование пролиферации и дифференцировки клеток показало большую способность тканевых трансплантатов к развитию.
Проблема стимуляции регенераторных процессов с использованием нейротрансплантации имеет важное биологическое и перспективное медицинское значение, поскольку хорошо известно, что у млекопитающих и человека ткань центральной нервной системы (ЦНС) обладает низкой способностью к восстановлению (Полежаев, Александрова, 1986; Ourednic V., Ourednic J., 2004). Вопрос о том, почему в ЦНС взрослых млекопитающих регенерация сильно ограничена, до сих пор является, пожалуй, одним из центральных в нейробиологии. Одна из гипотез, объясняющих неспособность клеток и поврежденных волокон нейронов к регенерации, связана с особенностями микроокружения в ЦНС. Опыты по трансплантации фрагментов периферического нерва в ЦНС показали, что поврежденные аксоны нейронов ЦНС могут далеко прорастать в трансплантаты, однако когда они снова попадают в ЦНС, их рост прекращается (Benfey, Aguayo, 1982; Schulz et al., 1993; Huebner, Strittmatter, 2009). Таким образом, можно предположить, что микроокружение, которое существует в ЦНС в норме, препятствует регенерации нервных волокон, а создание необходимых условий может способствовать росту поврежденных волокон. Существует ряд гипотез для объяснения ингибирующе-го действия микроокружения в ЦНС, например, отсутствие или недостаток растворимых нейро-трофических факторов (Berry, 1979), отсутствие компонентов внеклеточного матрикса, поддерживающих рост волокон (Carbonetto, 1984; Liesi, 1985), ингибирующее действие растворимых белков крови, которые проникают в ткань мозга при
разрушении гематоэнцефалического барьера после травмы (Heinicke, Kiernan, 1978), аутоиммунное ингибирование (Berry, Riches, 1974). Также олигодендроциты и продуцируемый ими миелин ингибируют рост поврежденных волокон (Savio, Schwab, 1989; Chen M. et al., 2000; Gaillard, Jaber, 2007). Важную роль играет низкая способность к регенерации за счет собственных молекулярных механизмов дифференцированных нейронов (Muramatsu et al., 2009).
Также на микроокружение и регенерацию в ЦНС влияет глиальная реакция и формирование глиального рубца в ответ на повреждение. Реактивная глия представляет собой как физический, так и физиологический барьер. В ответ на повреждение астроциты начинают пролиферировать и синтезировать факторы, подавляющие рост аксонов (Widestrand et al., 2007).
Известно, что микроокружение в зрелом и развивающемся мозге различается. Во взрослом мозге уровень нейротрофических факторов гораздо ниже, а из внеклеточного матрикса исчезают молекулы адгезии и навигации, способствующие распространению отростков нервных клеток (Sanes, 1989; Doucette, 1996; Liebl et al., 2003). Среда микроокружения в эмбриональном мозге, наоборот, способствует росту и активной регенерации. В развивающемся мозге происходят пролиферация, миграция и дифференцировка нейронов с интенсивным ростом нервных волокон, микросреда имеет высокий уровень растворимых и адгезивных белков внеклеточного матрикса, поддерживающих и направляющих эти процессы
(Liesi, 1985; Maisonpierre et al., 1990; Doucette, 1996). При трансплантации эмбриональных клеток среда микроокружения не только обеспечивает их развитие, но и влияет на клетки мозга реципиента, стимулируя регенераторные процессы (Ourednic V., Ourednic J., 2004; Andresa et al., 2008).
В качестве материала для трансплантации используют фрагменты эмбриональной нервной ткани или клеточные суспензии недифференцированных нейральных клеток. Изучение судьбы трансплантированных клеток чрезвычайно важно, поскольку восстановительный эффект зависит от клеточных и гуморальных взаимодействий между малодифференцированными клетками донора и зрелыми клетками мозга реципиента. Однако работ по сравнению поведения и дифферен-цировки клеток в цельных тканевых и суспензионных трансплантатах эмбриональной нервной ткани проведено мало, а современные методы дают возможность значительно расширить полученные ранее данные. Так, использование в качестве донора трансгенных животных, в клетках которых синтезируется зеленый флуоресцентный белок (GFP), позволяет легко выявлять и адекватно оценивать поведение клеток в тканях мозга реципиента, а методы иммуногистохимического окрашивания дают возможность детально характеризовать дифференцировку клеток. Поэтому целью данного исследования было изучение приживления и развития цельных тканевых и суспензионных аллотрансплантатов из ткани мозга 14-суточных эмбрионов мышей, в клетках которых синтезируется GFP, с использованием имму-ногистохимического окрашивания для анализа дифференцировки клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реципиентами служили взрослые самки мышей линии C57BL/6. Животным трансплантировали либо фрагменты зачатка неокортекса (13 мышей), либо суспензии диссоциированных клеток зачатков неокортекса (8 мышей). Источником донорской ткани служили эмбрионы мыши линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J (Okabe et al., 1997).
Плод извлекали на 14-е сут эмбрионального развития. Фрагмент зачатка неокортекса эмбриона мыши помещали в раствор Хэнкса. Пинцетом отделяли кусочек эмбриональной нервной ткани, после чего его забирали шприцом со стеклянной иглой. Для приготовления суспензии клеток кусочек неокортекса диссоциировали в растворе 0.1%-ного трипсина путем пипетирования с последующим центрифугированием для осаждения клеток. Подсчет клеток проводили в камере Горя-ева. Полученную суспензию забирали в шприц Гамильтон и трансплантировали в мозг мышам в объеме 2 мкл в концентрации 100000 кл./мкл. По
методическим причинам плотность клеток в цельном тканевом и суспензионном трансплантате различалась. Поэтому для суспензионного трансплантата было использовано оптимальное соотношение концентрации и объема согласно литературным данным (Terpstra et al., 2007). Объем тканевого трансплантата соответствовал объему суспензионного трансплантата.
Для проведения трансплантации взрослых мышей наркотизировали хлоралгидратом из расчета 300 мг/кг веса животного. Делали разрез кожи и отодвигали кожу и мышцы, обнажая черепную коробку. Бормашиной истончали кость и скальпелем проделывали в ней отверстие. Трансплантацию фрагментов проводили путем выдавливания кусочка неокортекса из шприца со стеклянной иглой, погруженной в мозг взрослого животного по координатам: от брегмы +0.45 мм, латерально 2 мм, 2.5 мм в глубину. Трансплантацию суспензии проводили по тем же координатам, но с использованием шприца Гамильтон. После трансплантации рану ушивали.
Исследование мозга животных-реципиентов проводили через 7 и 30 сут после трансплантации. Во всех случаях мышей усыпляли избыточной дозой хлоралгидратного наркоза. Для фиксации ткани мозга применяли транскардиальную перфузию раствором 0.01 М фосфатного буфера (PBS) при рН 7.4 в течение 10 мин, а затем холодным 4%-ным параформом на 0.01 М PBS в течение 20—30 мин. После фиксации головной мозг извлекали и оставляли в том же фиксаторе в течение нескольких часов на холоде. Затем мозг отмывали в 0.01 М PBS и помещали в раствор 30%-ной сахарозы на PBS на 1 сут.
Головной мозг резали на микротоме с замораживающим столиком. Полученные фронтальные срезы толщиной 20 мкм монтировали на предметные стекла, покрытые желатином. Затем либо сразу проводили иммуногистохимическое окрашивание, либо заключали в смесь глицерина, этиленгликоля и 0.1 М PBS (рН 7.4) в соотношении 5 : 5 : 6 соответственно и сохраняли в холодильнике при температуре —20°С. Процедура им-муногистохимической обработки наклеенных на предметное стекло срезов головного мозга проводилась с учетом рекомендаций фирм-производителей антител по стандартным протоколам. Исследуемые образцы инкубировали в растворе первичных антител в соответствующей концентрации в течение ночи при температуре 4°С (растворитель первичных антител: 0.3%-ный Triton X100 (Sigma, США), 10%-ная нормальная сыворотка козы (Sigma) на 0.01 М PBS (рН 7.4)). Затем, после отмывания в 0.01 М PBS, инкубировали в растворе вторичных антител, меченых флуорохромами, в течение 3 ч при комнатной температуре (растворитель вторичных антител: 0.3%-ный Triton X100,
0.01 М PBS (рН 7.4)). Готовые препараты заключали под покровное стекло в глицерин.
Для окраски препаратов использовали следующие первичные и вторичные антитела: антитела против Glial fibrillary acidic protein (GFAP) (кроличьи, поликлональные, разведение 1 : 200) (Chemicon, США), антитела против Neuronal Nuclei (NeuN) (мышиные, моноклональные, разведение 1 : 300) (Chemicon), антитела против Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) (мышиные, моноклональные, разведение 1 : 100) (Chemicon), антитела против тирозингидроксилазы (кроличьи, поликлональные, разведение 1 : 500) (Sigma), аnti-rabbit IgG (Texas Red conjugated, разведение 1 : 100) (Jackson ImmunoResearch, США), аnti-mouse IgG (Texas Red conjugated, разведение 1 : 100) (Jackson ImmuneResearch).
Микроскопическое исследование препаратов проводили с помощью комбинированного эпиф-луоресцентного микроскопа Opton-3 (Германия) и лазерного сканирующе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.