РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 1, с. 39-48
- ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ ==
ИММУНОГЛОБУЛИНЫ КЛАССА G ИЗ КРОВИ ЗДОРОВЫХ КРЫС WISTAR ОКИСЛЯЮТ АМИНЫ
© 2009 г. А.С. Толмачева1, Н.Л. Василенко2, Н.П. Заксас3, О.И. Синицина1, В.Н. Бунева2, Г.А. Невинский1,2
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия;
2Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия;
3Институт неорганической химии СО РАН, Новосибирск, Россия
Поступила: 29.04.08 г. Принята: 02.02.09 г.
Электрофоретически гомогенные препараты IgG были получены из крови девяти здоровых крыс линии Wistar аффинной хроматографией на Protein A-Sepharose. Показано, что поликлональные IgG гетерогенны по сродству к Protein A-Sepharose. После выделения все препараты IgG частично сохраняют связанные с ними эндогенные ионы металлов, относительное содержание которых зависит от индивидуального препарата и в среднем увеличивается в порядке: Fe > Pb > Zn > Cu > AI > Ca > Ni > Mn > Co > Mg. Показано, что в присутствии (пероксидазная активность) и в отсутствии Н2О2 (оксидоредуктазная активность) препараты IgG, содержащие эндогенные металлы, способны с высокой эффективностью окислять 3,3'-диаминобензидин (ДАБ), но полностью неактивны после удаления ионов металлов с помощью ЭДТА. Добавление 0,1 М КС1 в большинстве случаев активирует препараты IgG, но в некоторых случаях наблюдается ингибирование реакций пероксидазного и оксидоредуктазного окисления ДАБ. Предполагается, что различие в эффекте КС1 может быть связано с каталитической гетерогенностью абзимов, а также с разной эффективностью взаимодействия эндогенных ионов металлов с препаратами IgG и возможностью вытеснения некоторых из них из комплекса с АТ ионами K+.
Ключевые слова: абзимы, здоровые крысы Wistar, окислительно-восстановительные активности
ВВЕДЕНИЕ
Одной из основных причин развития в организме окислительного стресса является накопление активных форм кислорода (АФК), например, 02, Н202, и ОН и др., которые являются потенциальными окислителями ДНК, белков, липидов и других компонентов клеток человека [1—3]. АФК возникают как при действии внешних факторов (радиация, ультрафиолет, загрязнители воздуха и др.), так и активации эндогенных механизмов генерации активированных кислородных метаболитов в результате анаэробного дыхания у эукариот. Окислительный стресс, а также действие на человека мутагенов и канцерогенов приводит к старению человека и развитию большого числа различных патологий пожилого возраста: раковые заболевания, инфаркт миокарда, атеросклероз, диабет, катаракты, эмфиземы, различные дегенеративные заболевания моз-
Адрес: 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8 Институт химической биологии и фундаментальной медицины. E-mail: nevinsky@niboch.nsc.ru
га, сердца, мышц, аутоиммунные заболевания (АИЗ) и т.д. [1 — 2]. Учитывая это, особое внимание привлекает анализ механизмов защиты организма человека от АФК, а также от мутагенов и канцерогенов, которые в организме могут превращаться в АФК.
Критическими ферментами в защите живых организмов от АФК являются супероксид-дисмутазы, каталазы и глутатион-зависимые пероксидазы, которые обнаружены у человека, животных и растений [1 — 3]. Две известные супероксиддисмутазы эукариот являются Мп- и Си, 7п зависимыми, в то время как в некоторых бактериях обнаружены N1- и Бе-зависимые дисмутазы [4 — 5]. Бе2 + -зависимая каталаза человека в основном локализована в гепатоцитах и пероксисомах [3]. Каталаза превращает Н202 в Н20 и 02 ив основном локализована на внутренней мембране митохондрий. Пероксидаза специфических клеток высших эукариот относится к гем-металло-зависимым гликопротеидам, катализирует реакции оксидазного, пероксидазного и ок-сигеназного окисления субстратов [3]. Она
обнаружена в печени, почках, нейтрофилах и лейкоцитах. Основной особенностью механизма действия этой пероксидазы является отсутствие в специфичности выбора ферментом субстрата. Среди субстратов пероксида-зы встречаются функционально активные вещества: аскорбиновая кислота, мочевая кислота, адреналин, люминол, фенолы, и т.д. [3, 5, 6]. Единственным, не зависимым от ионов металлов, является глутатион пероксидаза, которая является селен-зависимым ферментом [3].
Известен ряд пероксидаз различных растений, которые по своим энзиматическим свойствам близки к одному из самых активных ферментов — пероксидазе хрена, также проявляющей широкую субстратную специфичность [3, 6]. Все известные пероксидазы растений являются Бе2+-порфирин зависимыми ферментами [3, 5, 6].
Не смотря на то, что супероксиддисмутаза, каталаза и глутатион пероксидаза в основном локализованы в различных клетках, их некоторое количество обнаруживается и в крови человека и животных, но после попадания в кровь эти ферменты быстро инактивиру-ют [3]. До последнего времени оставался открытым вопрос о том, выполняют ли в крови высших организмов антиокислительную функцию только перечисленные выше канонические ферменты или и другие белки могут выполнять защитную функцию.
За последние два десятилетия показано, что еще одним источником белков с различными каталитическими функциями являются 1д, которые получили название — абзимы (для обзора см. [7—12]). В литературе описано два основных пути наработки абзимов. С одной стороны, искусственные абзимы могут быть получены путем иммунизации животных химически стабильными аналогами переходных состояний химических реакций, использованными в качестве гаптенов [7]. В живых организмах молекулы некоторых пептидов и белков, а также нуклеиновых кислот и полисахаридов сами по себе или в комплексах с белками могут имитировать переходные состояния химических реакций и, как следствие, индуцировать наработку абзимов [12]. Так считается, что 1дС больных АИЗ, которые гидролизуют пептиды или белки: вазоактив-ный нейропептид (астма) [13], тиреоглобу-лин (тиреоидит Хашимото и ревматоидный артрит) [14, 15], протромбин (множественная миелома) [16], белковый фактор VIII (гемо-
филия) [17] и основной белок миелина (рассеянный склероз; 1дС, 1дМ и 1дА антитела) [18 — 20], являются АТ непосредственно против этих белков. АТ с ДНКазной, РНКазной и амилолитической активностями, обнаруженные при большом числе различных АИЗ (системная красная волчанка (СКВ), рассеянный склероз, полиартрит, тиреоидит Хашимото), лимфопролиферативные заболевания, полиневриты, злокачественные опухоли, а также вирусный гепатит и СПИД также могут быть АТ непосредственно против ДНК, РНК, полисахаридов, но в первую очередь их комплексов с белками [8—12].
Другим путем наработки природных абзи-мов является наработка вторичных антиидио-типических антител против активных центров ферментов, которые содержат в себе «внутренний образ» активных центров исходных ферментов и также обладают каталитической активностью [7 — 12]. С помощью этого подхода были получены моноклональные антиидио-типические абзимы с ацетилхолинэстераз-ной [21, 22], карбоксипептидазной [23, 24], и в-лактамазной [25] активностями. Содержание аутоантител в повышенной концентрации является особенностью пациентов с различными АИЗ и именно небольшие фракции ауто-АТ обладают самыми разными отмеченными выше каталитическими активностями [8—12]. В целом, биологическая роль абзимов при АИЗ пока остается до конца не ясной, однако в большинстве случаев они цитотоксич-ны и считается, что они могут иметь отрицательную роль в патогенезе АИЗ [8—12].
Недавно были получены неожиданные результаты о каталитических функциях 1д здоровых доноров. Показано, что АТ человека и животных обладают супероксиддисмутаз-ной активностью и превращают синглетный кислород Ю2 в его восстановленную форму О2- [26, 27]. Эти АТ в качестве источника электрона используют Н2О и присоединяя его к Ю2* образуют Н2О3 в качестве первого интермедиата нескольких последовательных стадий, ведущих к Н2О2. Эти данные свидетельствовали о защите организмов млекопитающих от Ю2* с помощью АТ и поставили вопрос о возможности специальной эволюции 1д как специфических антиоксидантов крови [26, 27]. Для 1д был открыт механизм, с помощью которого кислород может быть восстановлен и повторно использован при фагоцитозе, что указывает на возможность участия иммунной системы в микробной регуляции.
Еще более удивительным является открытие абзимов высших эукариот, катализирующих образование озона, используемого клетками при фагоцитозе [28].
Еще в 1998 г. группой Генералова показано, что препараты IgG крови здоровых доноров и пациентов с различными формами гепатита, выделенные с помощью хроматографии на протеин-А сефарозе, обладают пероксидазой активностью, они окисляли ароматический амин в присутствии Н2О2, но критерии принадлежности активности непосредственно АТ не были проверены [29].
Недавно было показано, что IgG антитела из крови здоровых крыс Wistar обладают высокими Н202-зависимой пероксидазной и Н202-независимой оксидоредуктазными активностями в окислении субстрата пероксидазы хрена — 3,3'-диаминобензидина и некоторых других ароматических аминов, фенолов и хинонов [30 — 32]. С использованием всех известных критериев отнесения активностей непосредственно АТ, было показано, что пероксидазная и оксидоредуктазная активности являются собственными свойствами IgG антител.
В данной работе проведен анализ содержания эндогенных ионов различных металлов в препаратах IgG и влияния одновалентных металлов на пероксидазную и оксидоредуктаз-ную активности IgG антител из крови крыс линии Wistar.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, глицин, тритон Х-100, бромфеноловый синий, ТЕМЕД, перекись водорода, ДАБ (Sigma, США), SDS (Merck, Германия), Трис (НеИсо^ Россия), колонки Superdex-200 (Pharmacia Biotech, Швеция). Остальные реактивы были квалификации ос. ч.
Выделение антител
Электрофоретически гомогенные препараты IgG антител были выделены из крови здоровых крыс Wistar аффинной хроматографией на Protein A-Sepharose в условиях удаления неспецифически связавшихся белков и селективной элюции IgG c колонки 0,1 М К-фосфатным буфером pH 4,6 согласно [33]. Фракции
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.