РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 4 с. 405-419
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ИММУНОГЛОБУЛИНЫ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ - КАТАЛИТИЧЕСКИ ГЕТЕРОГЕННЫЕ НУКЛЕАЗЫ
© 2008 г. А.Г. Барановский, В.Н. Бунева, Б.М. Доронин*,
Г.А. Невинский
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия;
* Новосибирская медицинская академия, Новосибирск, Россия
Поступила: 12.01.08 г. Принята: 26.03.08 г.
Впервые проведено сравнение высокоочищенных препаратов ДНКаз I и II человека с каталитически активными IgG (АТ) из крови больных рассеянным склерозом, катализирующих гидролиз ДНК. Обнаружены существенные различия температурной устойчивости и рН-стабильности ДНК-гидролизующих АТ и ДНКаз человека. По характеру Ме2+-зависи-мости реакции гидролиза ДНК с помощью IgG существенно отличаются от ДНКаз человека, а также от ранее описанных ДНК-абзимов из крови больных СКВ и молока здоровых рожениц. Выявлена гетерогенность ДНК-гидролизующих абзимов по сродству к ДНК-целлюлозе. Показано, что реакцию гидролиза катализируют как IgG, содержащие легкую цепь X, так и х-типа, но вклад последней в суммарную ДНКазную активность в 2,3 — 4 раза выше, чем Х-цепи. В отличие от канонических ДНКаз, поликлональные абзимы гидролизу-ют ДНК в широком диапазоне рН, что может указывать на отличие в оптимумах рН для различных субфракций IgG-дезоксирибонуклеаз, входящих в состав поликлональных АТ. Обсуждается выраженное многообразие оптимальных условий катализа реакции расщепления ДНК гетерогенными ДНК-абзимами при рассеянном склерозе и других аутоиммунных патологиях.
Ключевые слова: абзимы, кровь, рассеянный склероз, ДНКазы, гидролиз ДНК
ВВЕДЕНИЕ
В последние два десятилетия после открытия С. Полом в 1989 г. природных высокоспецифичных 1д с протеолитической активностью (абзимов) в крови больных астмой [1] были обнаружены IgG и/или 1дМ, гидролизую-щие ДНК, РНК, белки и полисахариды, выделенные из крови пациентов с различными аутоиммунными патологиями (АИП): СКВ, тиреоидит Хашимото, полиартрит, рассеянный склероз (РС), лимфопролиферативные заболевания, злокачественные опухоли, а также вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция (для обзора см. [2 — 6]). Кроме того, в молоке здоровых рожениц были обнаружены IgG- и sIgA-абзимы с нуклеазной, АТРазной, полисахарид- и казе-ин-гидролизующими, а также протеин- и ли-
Адрес: 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8, Институт химической биологии и фундаментальной медицины. E-mail: nevinsky@niboch.nsc.ru
пид-киназными активностями [2 — 9]. В то же время, АТ из крови здоровых доноров, а также больных гриппом, пневмонией, туберкулезом, тонзиллитом, язвой 12-перстной кишки и некоторыми онкологическими заболеваниями (рак матки, кишечника), протекающими без существенных нарушений иммунного статуса, не проявляли заметной активности [10—11].
Этиология РС — хронического демиелини-зирующего заболевания центральной нервной системы остается пока неясной. Характерной патоморфологической чертой РС является разрушение миелина — белково-ли-пидной мембраны, покрывающей нервные волокна в центральной нервной системе, а также повреждение самих нервных волокон различной выраженности (для обзора см. [12—13]). Хотя ведущим аутоиммунным механизмом при РС является Т-клеточный иммунитет, в развитии заболевания также участвует В-система (гуморальный иммунитет). Различные АТ-опосредованные эффекторные меха-
низмы могут прямо участвовать в повреждении миелина, олигодендроцитов и нервных волокон [12—13]. Одним из проявлений активации гуморального иммунитета при РС является повышенный синтез в ткани мозга и спинномозговой жидкости иммуноглобулинов (1д), обычно IgG [12—13], а также свободных легких цепей 1д [14]. Хотя основные мишени для этих IgG пока остаются неясными, при РС обычно выявляют АТ к основному белку миелина (ОБМ), миелин-олигодендро-цитарному белку, протеолипидному белку и другим антигенам миелина [12—13].
Недавно нами показано, что IgG [15], 1дМ и 1дА [16] из крови больных РС эффективно и специфически расщепляют ОБМ. Эти данные для IgG подтверждены в работе других авторов [17]. Кроме того, показано, что небольшая фракция IgG обладает специфической металлопротеазной активностью, гидро-лизующей ОБМ [18]. Расщепление ОБМ антителами может свидетельствовать об их участии в патогенезе этого заболевания. В то же время закономерности развития РС, скорее всего, имеют более сложный характер.
В ряде исследований у больных РС были также выявлены антиядерные АТ, среди которых, как правило, присутствуют анти-ДНК АТ. Процент больных РС, у которых обнаруживаются антиядерные АТ, варьировал от 17% до 81% [19 — 22], что сильно зависело от чувствительности метода и особенностей выборки больных. Присутствие антиядерных АТ при РС традиционно воспринималось только как одно из дополнительных свидетельств системного дисбаланса в иммунорегуляции, не имеющее самостоятельного патогенетического значения. В то же время было отмечено, что частота встречаемости этих АТ существенно выше у больных с неблагоприятным вторично-прогрессирующих течением РС [21] и обострениях заболевания [22].
Недавно было проведено клонирование и анализ IgG непосредственно из активных бляшек мозга одной больной РС и из В-кле-ток, присутствующих в ликворе другой [23]. Авторы показали, что высоко аффинные ан-ти-ДНК АТ являются основным компонентом внутримозгового IgG-ответа у обеих больных, а также наблюдали эффективное связывание полученных от этих больных ДНК-специфических моноклональных АТ с поверхностью нейрональных клеток и олигодендроцитов. Эти данные были интерпретированы авторами работы как доказательство ведущей роли анти-ДНК АТ в патогенезе РС.
В этой связи следует отметить, что исключительно отрицательную роль в развитии некоторых АИП могут играть каталитически активные АТ с ДНКазной активностью. Так ДНК-абзимы из крови больных СКВ и ДНК-гидролизующие белки Бенс-Джонса из мочи больных миеломой цитотоксичны и стимулируют гибель клеток по механизму апоптоза (для обзора см. [2 — 6]). Рассмотренные данные свидетельствуют о том, что в патогенезе РС могут быть важными АТ, связывающие и расщепляющие как ОБМ, так и ДНК.
Ранее нами были выделены из крови и спинномозговой жидкости больных РС гомогенные препараты 1дС, обладающие повышенным сродством к нуклеиновым кислотам (НК) [10]. Показано, что интактные 1д и их Fab-фрагменты обладают высокой каталитической активностью в реакциях гидролиза ДНК и РНК. Доказано, что способность гидролизовать НК является собственным свойством поликлональных АТ от больных РС [10, 24]. Интересно, что РНКазная активность АТ больных РС существенно отличается по специфичности от рибонуклеаз крови человека, РНКазы А и всех исследованных ранее абзимов.
Каталитически активные АТ против аналогов переходных состояний химических реакций и природные абзимы, как правило, обладают 102 — 106 раз более низкими удельными активностями по сравнению с обычными ферментами, катализирующими аналогичные реакции [2 — 6]. АТ из крови больных РС были первыми природными аутоабзимами, удельная активность которых от отдельных больных в гидролизе РНК-субстратов была сравнима с таковой для одного из наиболее быстродействующих ферментов расщепления РНК-РНКазы А [10].
В реакции гидролиза дека- и пентадекадез-оксирибонуклеотидов различной структуры, катализируемой одними и теми же препаратом IgG из крови больных РС, было обнаружено несколько величин КМ для субстратов, они лежали в диапазоне 20 — 200 нМ [24]. Это позволило предположить, что поликлональ-ные абзимы больных РС, подобно РНК-абзи-мам больных СКВ [25, 26], каталитически ге-терогенны [24].
В данной работе впервые проведено сравнение каталитических и физико-химических характеристик абзимов больных РС с классическими ДНКазами человека, направленное на выявление каталитической гетерогенности IgG.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали различные реактивы фирм «Sigma», «Pharmacia» и «Merck». Остальные реагенты были квалификации ос.ч. Получение и очистку ДНК плазмиды pBluescript проводили согласно протоколу фирмы QIAGEN. Электрофоретически гомогенные препараты IgG получали из крови и спинно-мозговой жидкости больных РС согласно [10-11].
Исследуемая группа больных рассеянным склерозом
Диагноз «рассеянный склероз» был верифицирован согласно общепринятым критериям Позера [27] неврологами 1-й Городской клинической больницы г. Новосибирска. При диагностике учитывались: возраст больных РС, пол, первые симптомы заболевания, длительность первого обострения и первой ремиссии, общая длительность заболевания, оценка состояния больного по функциональным шкалам Куртцке [28] с определением суммарного неврологического дефицита и степени инвалидности.
Аффинная хроматография IgG на ДНК-целлюлозе
В работе использовали электрофоретически и иммунологически гомогенные препараты IgG, полученные согласно [10]. Препарат IgG (1,5 мл, 0,7 мг/мл) наносили на колонку с ДНК-целлюлозой (1 мл, 7 х 30 мм), предварительно уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5. Затем колонку промывали этим же буфером и проводили элюцию градиентом концентрации NaCl (0-1 М) в 20 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,5 и 2 мл буфера (30 мМ глицин-HCl, pH 2,6, 150 мМ NaCl). Полученные фракции диализовали против 100-кратного избытка буфера 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, после чего оценивали их относительную активность в реакции гидролиза ДНК плазмиды pBluescript.
Выделение ДНКазы I человека
Мочу здоровых доноров (300 мл, утренняя порция) центрифугировали 30 мин при 1500g (5 С) и осадок удаляли. Белки мочи осаждали сульфатом аммония (80% насыщения) при рН 7,5 (20 мМ Трис-НО) в течение часа при 20 °С. Осадок отделяли центрифугированием при
12 000д (30 мин, 20 °С), растворяли в 10 мл 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, и диализовали против 1 л этого же буфера, содержащего 10 мкМ СаС12 (12 ч, 8 °С). Нерастворимый материал отделяли центрифугированием при 12000д (20 мин, 8 °С), и образец наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (5 мл, 11 х 50 мм), уравновешенную буфером: 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 10 мкМ СаС12. Элюцию проводили с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.