МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 2, с. 244-249
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.835:631.46:57.08
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ
рода агозншььим в почве с помощью
РОДОСПЕЦИФИЧНЫХ АНТИТЕЛ
© 2015 г. А. А. Широков, А. И. Красов, Н. Ю. Селиванов, Г. Л. Бурыгин,
С. Ю. Щеголев, Л. Ю. Матора1
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов Поступила в редакцию 27.11.2013 г.
Методами иммуноэлектрофоретического и иммунодиффузионного анализа с использованием антител на целые интактные клетки типового штамма почвенных азотфиксирующих бактерий Л10$р1г-Шыш Ъгазйетв $р7 выявлены не менее трех консервативных поверхностных иммуногенных белков азоспирилл, перекрестные реакции с которыми позволили использовать данные антитела для детекции азоспирилл в качестве родоспецифичного зонда в составе конъюгата с пероксидазой хрена как ферментативной меткой. Проведение прямого иммуноферментативного анализа почвенных суспензий (чернозем типичный, Саратовская обл.) подтвердило возможность использования ко-ньюгатов на основе родоспцефичных антител к поверхностным белкам азоспирилл для детекции бактерий этого рода непосредственно в природных образцах. Результаты работы составляют основу для широкой апробации предлагаемого метода с целью анализа распространенности бактерий рода Л10$рт11ыш в почвах.
Ключевые слова: иммуноферментный анализ, родоспецифичные антитела, ЛхозртПыш, почва.
DOI: 10.7868/S0026365615020135
В настоящее время методы иммуноанализа находят весьма широкое применение в микробиологии, в первую очередь, при работе с патогенными бактериями. Эти методы занимают третье место по частоте и интенсивности использования, уступая только "золотому" стандарту — методам, основанным на культивировании, и "серебряному" стандарту — молекулярно-генетическим приемам на основе полимеразной цепной реакции [ 1]. При этом иммуноанализ является, безусловно, самым быстрым по исполнению в сравнении с отмеченными двумя другими группами методов. Кроме того, приходится учитывать, что для анализа представителей почвенной микрофлоры методы, основанные на культивировании, пригодны весьма ограниченно, поскольку лишь относительно небольшая доля присутствующих в почве бактерий (обнаруживаемых микроскопическими и иными методами) поддается культивированию в лабораторных условиях [2, 3].
Число работ с использованием антител в качестве выявляющих структур при определении представителей почвенной микрофлоры пока сравнительно невелико. В том числе это касается бактерий рода Azospirillum, уже несколько десяти-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: larisa@ibppm.sgu.ru).
летий являющих признанным модельным объектом в исследовании феномена растительно-микробной ассоциативности. К настоящему времени опубликовано не более десятка работ, посвященных иммунохимическому выявлению различных штаммов этих бактерий на корнях растений [см., например, 4, 5]. Обширный ряд растений, в ризосфере которых обнаруживаются азоспириллы, свидетельствует о том, что эти бактерии не проявляют строгой специфичности по отношению к растению-хозяину и являются основными колонизаторами корней многих растений [6]. Разработка иммунохимических инструментов выявления азоспирилл открывает перспективы оперативного анализа их распространенности в почвах.
Одним из наиболее эффективных иммунохи-мических подходов является иммуноферментный анализ (ИФА), применимость которого для идентификации азоспирилл на примере Лzospirillыm ЪгазИете Сё (методом непрямого ИФА) в чистых и смешанных культурах, а также на корнях растений с использованием антител (Ат) на целые ин-тактные клетки данного штамма впервые была продемонстрирована Леванони и соавторами [7].
В серии наших работ установлено, что Ат на целые клетки азоспирилл распознают липополи-сахаридные и белковые поверхностные антигены
[8, 9], при этом липополисахарид (ЛПС) данных бактерий обладает выраженной штаммовой вариабельностью [10], что позволяет успешно использовать Ат на ЛПС для выявления штаммов определенных серологических типов в почвенных суспензиях методом непрямого ИФА [11]. При этом в последней работе ИФА был впервые применен для выявления соматического антигена интроду-цированных в почву бактерий A. brasilense Sp245 в модельных экспериментах, а также для оценки распространенности представителей серологических групп азоспирилл в различных типах почв Саратовской области.
В задачи настоящей работы входило получение данных о вариабельности поверхностных им-муногенных белков азоспирилл с целью создания иммуноферментного конъюгата, взаимодействующего с родо/видоспецифичными антигенами для выявления данных бактерий в почвенных образцах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы и условия культивирования. В работе использовали бактериальные штаммы из Коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН [12]: A. brasilense Sp7 (IBPPM 150), Sp245 (IBPPM 219), SR55 (IBPPM 18), A. lipoferum 59b (IBPPM 173), Azospirillum sp. SR14 (IBPPM 6) и типовой штамм Escherichia coli K-12. Культуры клеток выращивали до поздней логарифмической фазы роста в жидких питательных средах. Бактерии рода Azospirillum культивировали при 30°C на синтетической малатной среде [13] с добавлением NH4Cl (1 г/л), E. coli K-12 — при 37°C на среде LB [14].
Препараты антигенов наружных мембран. Для получения препаратов антигенов наружных мембран бактериальные клетки отмывали в забуфе-ренном физиологическом растворе (ЗФР), осаждали центрифугированием и экстрагировали в течение 30 мин при комнатной температуре в экстрагирующем буфере (pH 8.5) следующего состава: 0.1 М трис-HCl, 10 мМ этилендиаминтетраук-сусная кислота (ЭДТА), 0.1 мМ фенилметансуль-фонилфторид, 1% тритон X-100 (концентрация ЭДТА составляла 0.05 ммоль на 1 г влажных клеток). Экстракт освобождали от клеток центрифугированием. В некоторых случаях для денатурации белковых антигенов полученные препараты подвергали термообработке (100°C, 5 мин), а также воздействию протеолитического фермента. В последнем случае в препарат вносили протеиназу К ("Sigma", США), до конечной концентрации 80 мкг/мл и инкубировали в течение 60 мин при температуре 56—60°C.
Антитела. Для получения антител на целые клетки азоспирилл использовали типовой штамм
A. brasilense Sp7. Для иммунизации использовали суспензии клеток в ЗФР с оптической плотностью Ag60 = 0.5 в кювете толщиной l = 1 см (примерно 109 кл/мл). Кроликов иммунизировали трижды (с двумя двухнедельными интервалами), последовательно вводя в подколенные лимфатические узлы 0.5, 1.0 и 1.5 мл клеточной суспензии, смешанной с равным объемом адъюванта Фрейнда ("Difco", США). Для первой иммунизации использовали полный адъювант Фрейнда, для последующих — неполный адъювант. Отбор крови проводили через 6 сут после последней иммунизации. Фракции иммуноглобулинов G получали фракционированием антисыворотки 40% сульфатом аммония с последующим диализом против ЗФР и аффинной хроматографией на колонке Protein A-Sepharose 4B ("Sigma", США). Антитела разводили ЗФР до необходимой рабочей концентрации. Концентрацию иммуноглобулинов в растворах определяли спектроскопически при длине волны X = 278 нм, принимая оптическую плотность раствора иммуноглобулинов G в кювете l = 1 см при концентрации белка 1 мг/мл равной 1.4 [15].
Двойную иммунодиффузию проводили по стандартной методике [16].
Линейный иммуноэлектрофорез проводили в 1%-ных агарозных гелях, приготовленных на трис-глицин-барбитуровом буфере с ионной силой 0.02 и pH 8.8 в течение 30 мин при напряженности электрического поля 10 В/см. По окончании электрофореза в каждую траншею, сформированную путем удаления полоски агарозного геля, вносили по 100 мкл Ат (при концентрации 20 мг/мл). Гели после процедур отжима и многократной отмывки окрашивали Кумасси R-250 ("LKB-Bromma", Швеция).
Получение конъюгата иммуноглобулинов с пе-роксидаой хрена. Конъюгирование пероксида-зы хрена (ПХ) ("Sigma", США) с кроличьими Ат проводили перйодатным методом [17] с модификациями. В 1 мл дистиллированной воды растворяли 5 мг ПХ и добавляли 5 мкл 0.18 М раствора метаперйодата натрия, инкубировали 20 мин при комнатной температуре и обессоливали на колонке PD-10 с сефадексом G-25, уравновешенным 0.001 М ацетатным буфером (рН 4.0). Собирали фракции, содержащие ПХ, доводили рН до 9.5 с помощью 0.2 М гидроксида натрия и добавляли 10 мг иммуноглобулинов G, растворенных в 1 мл 0.01 М натрий-карбонатного буфера (рН 9.5). Реакцию проводили в течении 2 ч с постоянным перемешиванием при комнатной температуре. Полученное основание Шиффа восстанавливали добавлением 0.1 мл 0.064 М водного раствора ци-анборгидрида натрия и инкубировали 2 ч при 4°С. Конъюгат обессоливали на колонке с сефадексом G-25 ("Amersham Biosciences", США), урав-
новешенным 0.025 М трис-НС1 буфером (рН 8.2). Очистку полученного коньюгата от непрореаги-ровавших остатков пероксидазы и антител проводили методом анионообменной хроматографии на колонке 1 х 9 см с сорбентом DEAE-Toyopearl HW 650 M ("Tosoh Bioscience", Япония) в 0.025 М трис-НС1 буфере с градиентом хлорида натрия от
0 до 0.3 М при скорости 1 мл/мин. Детектирование осуществляли при длине волны 278 нм. Собранные фракции разделенных пиков дополнительно фотометрировали при длине волны 405 нм для выявления пероксидазы и ее конъюгата с антителами.
Иммунодот-анализ бактериальных суспензий.
1 мкл бактериальной суспензии (A660 = 0.5) наносили на нитроцеллюлозную мембрану в центр очерченного квадрата со стороной 5 мм, и выдерживали образец в сухо-жаровом шкафу в течение 15 мин при 60°C. После блокирования мест неспецифической сорбции в течение 30 мин при комнатной температуре в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА), образцы помещали в конверт из пленки "Parafilm" и инкубировали в растворе антител, конъюгированных с ПХ, содержащем 0.01% БСА и 0.02% Твин-20, в течение 1 ч при комнатной температуре (конечная концентрация антител составляла 1 мг/мл). После отмывания ЗФР, содержащим 0.02% Твин-20 (3 раза по 15 мин), образцы помещали в раствор субстрата для оценки пероксидазной активности, представляющего собой 0.03%
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.