БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2009, том 35, № 4, с. 533-541
УДК 543.645:616.931
ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ И ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИОННАЯ СИСТЕМЫ ДЕТЕКЦИИ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА
© 2009 г. Н. А. Бызова*#, В. В. Свиридов2*, Н. Ф. Гаврилова2*, Е. Н. Распопова2*, И. В. Яковлева2*, А. Н. Генералова3*, Ю. В. Лукин3*, В. В. Черкасова4*, А. В. Жердев*, Б. Б. Дзантиев*
*Институт биохимии им. АН. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33; 2*НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва; 3*Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; 4*Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
им. Г.Н. Габричевского, Москва Поступила в редакцию 13.10.2008 г. Принята к печати 26.11.2008 г.
С использованием двух моноклональных антител, специфичных к разным эпитопам дифтерийного токсина, разработаны системы ускоренного выявления токсигенности коринебактерий дифтерии, основанные на иммунохроматографической и латекс-агглютинационной детекции дифтерийного токсина. Методы апробированы на выборке из 36 клинических изолятов. Показана возможность достоверного выявления токсигенных свойств штаммов Corynebacterium после подращивания изолятов в течение 1 сут. Разработанные методы позволяют определять дифтерийный токсин в концентрациях до 3-4 нг/мл. Благодаря существенному сокращению времени по сравнению с традиционными микробиологическими методами разработанные тест-системы являются перспективными средствами диагностики дифтерии.
Ключевые слова: дифтерийный токсин; иммунохроматографический анализ; реакция латекс-агглютинации.
ВВЕДЕНИЕ
Дифтерийная токсикоинфекция остается смертельно опасным заболеванием, и своевременная оценка токсигенных свойств возбудителей, изолированных от больных и общавшихся с больными лиц, необходима для правильного выбора терапевтических и противоэпидемических мероприятий [1]. Дифтерийный токсин (ДТ, белок М 62 кДа) является основным фактором патогенности возбудителя, ответственным за развитие тяжелых осложнений, таких, как поражение миокарда, полиневропатии, токсическое поражение печени и др. [2]. Для выявления ДТ в массовой клинико-диагностической практике, как правило, применяется реакция имму-нодиффузии в агаре. С учетом времени, необходимого для взятия мазка, посева, выделения чистой культуры, постановки реакции и формирования преципитатов токсина с антисывороткой, заключе-
Сокращения: ББ - 0.1 М боратный буфер, рН 8.2; ДАТ -дифтерийный анатоксин; ДТ - дифтерийный токсин; ИХА -иммунохроматографический анализ; МА - моноклональные антитела; МЦТ - микроцитотоксичность; РЛА - реакция латекс-агглютинации; СПК - сыворотка плода коровы; ФБС - 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7.4, с 0.1 М №С1; ФБСТ - ФБС с 0.05% Твина-20; й - единица флокуляции.
# Автор для связи (тел.: (495) 9544009; факс: (495) 9542804; эл. почта: nbyzova@inbi.ras.ru).
ние о токсигенности возбудителя получают на третьи-четвертые сутки. Для совершенствования диагностики было предложено ускоренное и существенно более чувствительное выявление ДТ методом твердофазного ИФА в жидкой среде подращивания возбудителя [3]. Применяя моноклональные антитела к ДТ, можно даже без выделения чистой культуры через сутки после взятия мазка выявлять токсин в концентрации до 0.001 единиц флокуляции (Ь^) на 1 мл [4, 5], что в десятки раз ниже порога детекции иммунодиффузионных тестов. Однако твердофазный ИФА также не вполне удобен для массового применения, поскольку его проведение требует специального приборного оснащения.
В настоящее время для детекции различных соединений активно используются экспрессные имму-нохимические тесты с длительностью до 10 мин, сочетающие высокую чувствительность с простотой постановки, возможностью быстрого получения ответа при бесприборной (визуальной) регистрации результатов [6-9]. Несомненный интерес представляет детекция ДТ с помощью иммунохроматогра-фического анализа (ИХА) и реакции латекс-агглютинации (РЛА).
На сегодняшний день диагностика дифтерии с помощью данных форматов анализа рассматрива-
[МА], нг/мл
Рис. 1. Иммуноферментная регистрация концентрационных зависимостей связывания индивидуальных препаратов МА ДТ-17 (1), МА ДТ-22 (2) и их эквимо-лярной смеси (3) с иммобилизованным ДАТ. Пунктиром показан результат суммирования кривых 1 и 2.
лась лишь в единичных работах [10, 11]. Проведенные исследования ограничивались демонстрацией принципиальной реализуемости одного из методов и его пригодности для тестирования биопроб. Для формирования доказательной основы перехода к экспрессным иммунохимическим тестам целесообразно, используя одни и те же иммунореагенты, реализовать различные методы иммунодетекции ДТ и сопоставить их при анализе одной и той же выборки образцов.
С учетом имеющейся реагентной базы - ранее полученных и описанных в работах [4, 5] монокло-нальных антител (МА) против ДТ - задачей настоящего исследования являлась разработка на основе этих антител методов иммунохроматографическо-го и латекс-агглютинационного выявления дифтерийного токсина и их сравнение с традиционным микропланшетным ИФА.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе были использованы антитела МА ДТ-17 и МА ДТ-22, способность которых нейтрализовать действие ДТ была показана в микроцитоток-сическом тесте (МЦТ) на культуре чувствительных к токсину клеток СНО [12, 13].
Для анализа взаимного расположения антигенных детерминант, распознаваемых антителами двух клонов, в соответствии с предложенным в работе [14] подходом, были сопоставлены концентрационные зависимости связывания индивидуальных клонов и их эквимолярной смеси (рис. 1). Прирост сиг-
нала в смесн антител по сравнению с зависимостями для индивидуальных клонов свидетельствует о взаимодействии антител с разными детерминантами ДТ.
С использованием МА ДТ-17 и МА ДТ-22 разработана иммунохроматографическая система детекции ДТ. Данный вид анализа основан на движении элюента вдоль мембраны под действием капиллярных сил, которое приводит к образованию на участках мембраны с иммобилизованными иммунореа-гентами визуализуемых иммунных комплексов. Благодаря специфичности антител к разным детерминантам ДТ возможен двухсайтный сандвич-им-муноанализ, как правило, более чувствительный по сравнению с другими форматами.
Выбор нагрузки МА на коллоидных частицах проводили, согласно рекомендациям [15, 16], предусматривающим анализ оптического поглощения растворов коллоида при 580 нм в присутствии сорбируемого белка в разных концентрациях. На рис. 2 представлены полученные концентрационные зависимости. Как видим, добавление антител вначале приводит к росту оптического поглощения, после чего величина Л580 резко уменьшается и выходит на плато. Концентрация МА, соответствующая стабилизации Л580, рассматривается как обеспечивающая насыщение центров иммобилизации. В качестве оптимальной принимается концентрация МА, на 10-15% превосходящая точку выхода на плато [15, 16]. Для МА ДТ-17 была выбрана концентрация 23, а для МА ДТ-22 - 15 мкг/мл.
Для получения в ходе ИХА четких, хорошо визуализуемых зон была определена оптимальная комплектация тест-систем. Для формирования контрольной зоны использовали кроличьи (RAMIss, два препарата), козьи (GAMIss, три препарата) и овечьи (SAMIss, два препарата) антитела против иммуноглобулинов мыши производства фирмы "Им-тек". Были выбраны овечьи антитела SAMIss 1, так как они обеспечивали максимальное связывание коллоидных конъюгатов (рис. 3). Для формирования аналитической зоны использовали МА против ДТ.
Были изготовлены иммунохроматографические тест-полоски двух видов: в первом варианте на мембране иммобилизовали МА ДТ-17, а с коллоидным золотом конъюгировали МА ДТ-22; во втором на мембрану наносили МА ДТ-22, конъюгируя с золотом МА ДТ-17. При оптимизации протоколов анализа применяли дифтерийный анатоксин (ДАТ) ввиду его большей стабильности и безопасности манипуляций. Окончательную характеристику тест-систем проводили с использованием ДТ. Первый вариант тест-полосок позволяет выявлять ДАТ в концентрациях от 30 нг/мл (рис. 4а, в); с помощью второго варианта ДАТ определяется в концентрациях от 4 нг/мл (рис. 46, в). Максимальная интенсивность окраски аналитической зоны для второго варианта тест-полосок в 1.5 раза больше, чем для пер-
^580 (а)
[МА ДТ-17], мкг/мл ¿580 (б)
[МА ДТ-22], мкг/мл
Рис. 2. Концентрационные зависимости иммобилизации МА против ДТ (а - МА ДТ-17, б - МА ДТ-22) на частицах коллоидного золота. Стрелками указаны концентрации МА, оптимальные для получения стабильных конъюгатов с коллоидным золотом.
вого. Таким образом, предпочтительным является второй вариант. Предложенная система ИХА позволяет детектировать ДАТ и ДТ в течение 10 мин в концентрациях, соответствующих требованиям медицинской диагностики.
Вторым реализованным видом экспрессного анализа была реакция латекс-агглютинации. Исходя из соображений стабильности конъюгатов, был выбран вариант прямой латекс-агглютинации, в котором используются латексные частицы с иммобилизованными на их поверхности антителами. Синтезированные монодисперсные полиакролеиновые частицы имели средний диаметр 1.65 мкм и концентрацию альдегидных групп 30 мкмоль на 1 г.
I, усл.ед.
Рис. 3. Взаимодействие в иммунохроматографиче-ской системе различных иммобилизованных антивидовых антител с МА против ДТ, конъюгированными с коллоидным золотом. Антитела: RAMIss 1 (1), RAMIss 2 (2), GAMIss 1 (3), GAMIss 2 (4), GAMIss 3 (5), SAMIss 1 (6), SAMIss 2 (7). Черные столбцы соответствуют МА ДТ-17, заштрихованные столбцы - МА ДТ-22.
Разработка системы РЛА была начата с выбора концентрации МА для иммобилизации на поверхности латексных частиц [17]. О сорбции МА судили по агглютинации диагностикума кроличьей антисывороткой к мыши. Показано, что оптимальная концентрация МА равна 2 мкг/мл, а ее превышение приводит к спонтанной агглютинации. Диа-гностикумы на основе МА ДТ-17 или МА ДТ-22 агглютинировались кроличьей сывороткой против мыши, но практически не давали отклик при добавлении ДАТ. Отсутствие агглютинации с ДАТ можно объяснить специфичностью антител к уникальным, неповторяющимся детермина
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.