ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 616-623
УДК 543.066:57.083.3
ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ Т-2 ТОКСИНА
© 2015 г. А. В. Петракова*, А. Е. Урусов*, М. В. Возняк**, А. В. Жердев*, Б. Б. Дзантиев*
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: dzantiev@inbi.ras.ru **ООО "ИЛ Тест-Пущино", Пущино Московской обл., 142290 Поступила в редакцию 08.06.2015 г.
Разработана иммунохроматографическая тест-система для детекции Т-2 токсина (Т2Т), одного из приоритетных контаминант зерновой продукции. Детекция основана на конкуренции содержащегося в пробе Т2Т и иммобилизованного на тест-полоске конъюгата Т2Т—белок за связывание с комплексами антител против Т2Т и маркера — золотых наночастиц. Результат конкуренции регистрируется по окрашиванию маркером аналитической зоны тест-полоски. Установлено, что для достоверного высокочувствительного анализа оптимально разведение пробы при конечной концентрации метанола 20%. Показано, что замедление движения реагентов вдоль тест-полоски, которое обеспечивалось использованием дополнительных мембран, пропитанных 10%-ным БСА, приводило к снижению предела детекции Т2Т. Тест-система апробирована для выявления Т2Т в водно-метаноль-ных экстрактах зерен кукурузы. Исчезновение окрашивания аналитической зоны, свидетельствующее о присутствии микотоксина, наблюдалось для проб зерна, содержащих от 53 мкг/кг Т2Т (концентрация Т2Т при проведении иммунохроматографии — 3 нг/мл). При видеоцифровой регистрации предел выявления Т2Т составил 16 мкг/кг (0.9 нг/мл). Продолжительность тестирования — 15 мин. Полученные данные свидетельствуют о пригодности разработанной тест-системы для контроля превышения максимальных допустимых уровней содержания Т2Т.
Ключевые слова: иммунохроматография, Т-2 токсин, растительные экстракты, водно-органические смеси, безопасность пищевой продукции.
DOI: 10.7868/S0555109915060112
Иммунохроматографический анализ (ИХА) — метод, основанный на использовании меченых иммунореагентов и тест-полоски (мультимем-бранного композита), в определенных участках которой до проведения анализа иммобилизованы антигены и/или антитела. Контакт тест-полоски с тестируемой пробой приводит к движению впитывающейся жидкости и вымываемых иммунореагентов вдоль тест-полоски, сопровождающемуся формированием иммунных комплексов, которое можно контролировать по связыванию метки. Принципиальными преимуществами иммунохроматографии являются быстрая (до 15 мин) и простая методика тестирования, не требующая дополнительных реагентов и оборудования [1, 2].
Однако иммунохроматография, как правило, уступает по чувствительности альтернативным иммуноаналитическим методам — иммунофер-ментному анализу (ИФА) и др. Это связано как с неравновесным режимом проведения взаимодействий, продолжительность которых лимитируется движением реагентов вдоль тест-полоски, так и с необходимостью использовать довольно высокие концентрации маркера, чтобы иметь воз-
можность видеть его связывание невооруженным глазом [2, 3]. Большое количество работ последних лет посвящено изучению подходов, позволяющих преодолевать эти ограничения ИХА, — различным способам усиления детектируемого сигнала, применению альтернативных маркеров, выявляемых в низких концентрациях, оптимизации состава иммунореагентов и др. [4—7]. Однако, наряду с этими общими решениями, значительный интерес представляют разработки, улучшающие характеристики ИХА определенных классов соединений. Так, при детекции веществ, плохо растворимых в водно-солевых средах, исходные пробы для тестирования представляют собой экстракты в органических растворителях. Денатурирующее действие последних на белки (в том числе на антитела) не позволяет непосредственно использовать такие пробы для ИХА, а значительные разведения проб вызывают пропорциональные потери чувствительности. Поэтому для водонерастворимых антигенов необходимы методические решения, минимизирующие негативное влияние экстрагента и позволяющие увеличить время взаимодействия иммунореагентов при их
движении вдоль тест-полоски, оставаясь в рамках экспрессного (не более 15 мин) тестирования.
В качестве модельного соединения был выбран Т-2 токсин (8-(3-метилбутирилокси)-4,15-диаце-токси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-3-ол, Т2Т), который относится к микотоксинам — продуктам жизнедеятельности плесневых грибов, паразитирующих на растениях, в том числе на многих сельскохозяйственных культурах. Основные продуценты Т2Т — грибы рода Fusarium (F. sporotri-chioides, F. acuminatum, F. culmorum, F. equiseti, F. gra-minearum, F. moniliforme, F. myrothecium, F. poae и др.), хотя описана способность к синтезу Т2Т и других грибов. Т2Т и другие структурно близкие трихотеценовые микотоксины относятся, наряду с зеараленоном, к высокоширотным микотоксинам. Сельскохозяйственная продукция, контами-нированная Т2Т чаще всего выявляется в России, Японии, Аргентине, Бразилии. Спектр поражаемых культур довольно широк. К первоочередным объектам мониторинга следует отнести овес, пшеницу, ячмень, рожь, рис, сорго. Встречаемость Т2Т особенно высока в культурах, используемых в качестве кормов для сельскохозяйственных животных [8-12].
Негативное биологическое действие Т2Т характеризуется поражением кроветворных и им-мунокомпетентных органов, а также желудочно-кишечного тракта, лейкопенией, анемией, развитием геморрагического синдрома. Т2Т обладает высокой острой токсичностью (LD50, установленные для различных видов млекопитающих, варьируют от 3 до 10 мг/кг массы тела) [13, 14]. Как и для многих других микотоксинов, для Т2Т характерна высокая стабильность - как в биологических средах, так и при изготовлении пищевой продукции [15]. Попав в агротехническую пищевую цепь, Т2Т продвигается по ней, создавая тем самым серьезные риски для здоровья людей [16, 17].
Токсичность и распространенность Т2Т обусловливают необходимость эффективных методов для массового контроля данного соединения [2, 18]. При этом на стадии пробоподготовки тестируемых твердых продуктов питания и кормов должно проводиться их измельчение и экстракция микотоксина. Поскольку растворимость Т2Т, как и большинства других микотоксинов, в воде крайне невысока, в качестве экстрагентов используют водно-органические смеси, из которых наиболее широко применяется смесь метанол : : вода = 70 : 30 (по объему) [19, 20]. При тестировании препаратов с высоким содержанием органических растворителей наблюдается денатура-ционная инактивация иммунореагентов - компонентов тест-системы [21]. Общее решение данной проблемы на сегодняшний день не предложено. Отсутствуют единые представления об оптимальном содержании метанола в пробе, ко-
торую следует использовать при проведении ИХА. В существующих публикациях по ИХАТ2Т [22—24] и в коммерческих тест-системах (производства фирм "R-biopharm AG", "Neogen Corporation", "Charm Sciences", "AC Diagnostics", "Quicking Biotech Co") уровень органического растворителя варьирует от 4 до 14%, а обоснования выбранного протокола тестирования не приводятся.
Цель работы — разработка иммунохроматогра-фической тест-системы для детекции Т-2 токсина, включающая выбор оптимального содержания органического экстрагента в тестируемой пробе и оценку возможностей изменения продолжительности иммунохимических взаимодействий в ходе анализа.
МЕТОДИКА
Реактивы. В работе использовали золотохло-ристоводородную кислоту, цитрат натрия, азид натрия, дигидрохлорид 3,3',5,5'-тетраметилбен-зидина (ТМБ), детергенты тритон X-100 и твин-20 фирмы "Sigma-Aldrich" (США). Т-2 токсин, бычий сывороточный альбумин (БСА) — "MP Biomedicals" (США), трис и сахарозу — "Ре-ахим" (Россия). Конъюгат Т2Т-БСА и мышиные моноклональные антитела против Т2Т предоставлены ООО "ИЛ Тест-Пущино" (Россия), стандартный препарат раствора Т2Т (государственный стандартный образец, 100 мкг/мл) изготовлен ООО "Хромресурс" (Россия). Антитела козы против иммуноглобулинов (IgG) мыши — производства "Arista Biologicals" (США), меченные пероксидазой антитела против иммуноглобулинов (IgG) мыши — НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (Россия).
Все вспомогательные реагенты (соли, кислоты, щелочи, органические растворители) — аналитической или химической чистоты.
Растворы для получения наночастиц золота (НЧЗ) и конъюгатов НЧЗ с антителами готовили на деионизированной воде (система Simplicity, "Milli-pore" (США), удельное сопротивление при 25°С не менее 18.2 Мом • см).
Для получения экстрактов использовали метанол производства "Fluka" (США), а для их фильтрации — бумажные фильтры класса 589/2, диаметр 125 мм ("Schleicher & Schuell", Германия).
При изготовлении иммунохроматографиче-ских тест-полосок использовали следующие компоненты:
1) нитроцеллюлозные рабочие мембраны на твердой основе марок CNPOO и CNP05 ("Advanced Microdevices", Индия), HF240 и HF75 ("Millipore", США), FF80HP, FF170HP, Immunopore SP и Immunopore RP ("General Electric", США);
2) стекловолоконную мембрану марки PT-R7 ("Advanced Microdevices");
3) мембрану для нанесения пробы марки GFB-R7L (0.6) ("Advanced Microdevices");
4) конечную адсорбирующую мембрану марки AP045 ("Advanced Microdevices").
ИФА проводили в 96-луночных прозрачных полистироловых микропланшетах марки Costar 9018 "Corning Costar" (США).
Определение Т2Т методом конкурентного ИФА. Методика ИФА была предложена на основании наших предыдущих работ [25, 26]. В лунках микропланшета в течение ночи при +4°C сорбировали конъюгат Т2Т—БСА в концентрации 1.0 мкг/мл из 100 мкл 50 мМ фосфатного буфера, pH 7.4 (ФБ). После четырехкратной отмывки лунок ФБ, содержащим 0.05% тритона Х-100 (ФБТ), вносили по 50 мкл раствора Т2Т, разбавленного до 100 — 0.005 нг/мл в ФБТ, а затем добавляли по 50 мкл раствора антител против Т2Т в концентрации 100 нг/мл и инкубировали 1 ч при 37°C. После четырехкратной отмывки ФБТ в лунки вносили по 100 мкл раствора меченных пероксидазой антител против иммуноглобулинов мыши (коммерческий препарат, разведенный 1 : 3000 в ФБТ) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Затем микропланшет отмывали 4 раза ФБТ.
Для определения активности пе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.