БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 4, с. 277-284
УДК 57.083.3
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ БИОЧИПЫ ДЛЯ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ И МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК
© 2008 г. А. В. Шишкин1' 2*, И. И. Шмырев1, С. А. Кузнецова1, Н. Г. Овчинина1' 2, А. А. Бутылин1, 3, Ф. И. Атауллаханов1, 3' 4, А. И. Воробьев1
1 ГУ Гематологический научный центр РАМН, 125167 Москва, Новозыковский проезд 4-а;
факс (495) 612-4252; электронная почта: shishkin_lab@mail.ru
2 Ижевская государственная медицинская академия, 426034 Ижевск, ул. Коммунаров, 281;
факс: 8-(3412) 65-81-67
3 Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва ГСП-1, Ленинские горы; факс: (495) 939-01-26 4 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, 117977 Москва ГСП-1, ул. Косыгина, 4 Поступила в редакцию 05.04.2008 г.
Описано исследование лимфоцитов с помощью экспериментальных биочипов, позволяющих определять на поверхности клеток 26 различных CD-антигенов, а также антигены HLA-DR и IgM. Биочипы представляют собой прозрачные пластиковые подложки, на которые нанесены пятна антител (IgG), специфичных для данных антигенов. Диаметр каждого пятна составляет 1.5 мм. С помощью этих биочипов исследованы нормальные и опухолевые лимфоциты. Показана возможность использования биочипов для определения процентного содержания в суспензиях клеток, экспрессирую-щих различные поверхностные антигены. Полученные при этом результаты совпадают с данными проточной цитофлуориметрии. Использование прозрачной подложки позволяет применять к связавшимся на биочипе клеткам стандартные методы окраски и проводить их морфологическое исследование.
В настоящее время быстро развиваются новые методы анализа, основанные на применении биочипов - аналитических и диагностических систем нового поколения, использующих принцип молекулярного узнавания и позволяющих одновременно осуществлять множество однотипных исследований в небольшом количестве материала [1].
Биочип представляет собой носитель, в определенных участках которого иммобилизированы молекулы, способные специфически взаимодействовать с молекулами, присутствующими в исследуемом образце [2]. Все большее распространение получают биочипы на основе антител, позволяющие одновременно выявлять большое число различных антигенов [3]. Для изготовления биочипов используются подложки из различных материалов, обеспечивающих иммобилизацию антител за счет ковалентного связывания с поверхностью [1, 4-7] или за счет адсорбции [8, 9].
Впервые связывание клеток на биочипе с иммо-билизированными антителами, специфичными к поверхностным антигенам, описал Чанг [10]. В последние годы несколькими группами исследователей разработаны биочипы, позволяющие определять поверхностные антигены клеток [5, 11-18].
* Автор для переписки.
Значительная часть этих работ посвящена созданию биочипов с иммобилизированными на них антителами, специфичными к поверхностным антигенам лейкоцитов [11-17].
Определение СБ-антигенов, экспрессируемых на поверхности клеток, имеет большое значение для диагностики опухолей системы крови [19]. Для иммунофенотипирования клеток широко используется метод проточной цитофлуориметрии. К недостаткам этого метода можно отнести возможность одновременного определения лишь небольшого числа антигенов, в то время как количество клинически значимых антигенов достаточно велико. Биочипы позволяют одновременно определять очень большое число поверхностных антигенов, ограниченное только количеством пятен различных антител, которые могут быть нанесены на подложки.
Диагностически значимым показателем является доля клеток, несущих определенные антигены. Поэтому биочипы должны не только избирательно связывать клетки, экспрессирующие соответствующие антигены, но и позволять определять их процентное содержание.
Описаны биочипы с различным количеством иммобилизированных антител [6, 11-13, 20]. В ра-
боте Като и соавт. [6] описаны биочипы, содержащие 22 антитела, специфичные к различным CD-антигенам. С их помощью исследовали кровь больных острым Т- лимфобластным лейкозом (Т-ОЛЛ), лимфомой Беркитта и острым промиелоцитарным лейкозом. Были установлены наборы CD-антигенов, экспрессируемых на поверхности опухолевых клеток, однако количественное определение процентного содержания клеток, экспрессирующих каждый из выбранных поверхностных антигенов не проводилось. В работе Белова и соавт. [11] с помощью биочипов с антителами, специфичными к 48 различным CD-антигенам, определены наборы антигенов, встречающихся на поверхности лимфоцитов здоровых доноров, больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом (В-ХЛЛ), волосато-клеточным лейкозом, лимфомой из клеток мантийной зоны и Т-ОЛЛ. Содержание клеток с различными CD-антигенами определено в крови здоровых доноров и больных В-ХЛЛ. В более поздних работах той же группы [12, 13] с помощью биочипов, позволяющих определять до 82 различных CD-антигенов, проведено аналогичное исследование клеток нескольких опухолей (острого В-лим-фобластного лейкоза, Т-ОЛЛ, Т- клеточного про-лимфоцитарного лейкоза, и острого промиелоци-тарного лейкоза).
В клинической практике одним из важнейших методов диагностики опухолей системы крови наряду с иммунофенотипированием является морфологическое исследование клеток. Существующие диагностические методы не позволяют проводить эти два вида исследований на одних и тех же клетках, что иногда приводит к противоречиям при постановке диагноза. Поэтому весьма привлекательной представляется возможность морфологического исследования связанных на биочипе клеток. Для реализации данной возможности необходимо изготовление биочипов на прозрачных подложках.
Задача данной работы состояла в создании биочипа, позволяющего совместить определение содержания в суспензии клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены, и их морфо-логическоео исследование.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. Для создания биочипов использовали мышиные моноклональные антитела (IgG), специфичные к антигенам человека: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM (ООО "Сорбент", Москва). В работе использовали также обезжиренное сухое молоко ("Kroger", США), раствор для градиентного центрифугирования Ficoll-paque, EDТА,
фосфатный буфер (PBS) pH 7.4, детергент Tween-20, метанол (все "Sigma Aldrich", США).
Приготовление клеточной суспензии. Лимфоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-paque. Клетки ресуспендировали в растворе PBS, содержащем 0.1% сухого молока, 10% инактивиро-ванной нагреванием человеческой сыворотки и 1.5 мМ EDTA. Содержание клеток в суспензии определяли с помощью камеры Горяева.
Изготовление биочипов. В качестве подложек для изготовления биочипов использовали покровные стекла (22 х 22 мм) из пластифицированного поливинилхлорида ("Fisher Scientific", США). Капли (0.5 мкл) растворов антител с различным разведением наносили на подложки автоматической пипеткой в заранее отмеченные участки. Подложки с адсорбированными антителами помещали в камеру со 100% влажностью и инкубировали при +4°С в течение ночи, после чего высушивали на воздухе и замораживали при -26°С в герметичных контейнерах с осушителем (силикагель). При таком хранении биочипы не теряли своих свойств, по меньшей мере, в течение 12 мес. Диаметр пятен иммобилизированных на биочипе антител составлял 1.5 мм.
Подготовка биочипов к работе. После размораживания биочипы закрепляли в чашках Петри (35 мм), ополаскивали 1% раствором обезжиренного сухого молока в PBS и трижды отмывали 0.05% раствором Tween-20. После этого чашки вновь заполняли 1% раствором обезжиренного сухого молока в PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со слабым перемешиванием на шейкере. Затем биочипы снова 3 раза отмывали 0.05% раствором Tween-20 и ополаскивали буфером для удаления следов детергента.
Инкубация биочипов с клеточной суспензией.
Клеточную суспензию вносили в чашки Петри с закрепленными в них биочипами. Клетки инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 30-40 мин. Концентрация клеток и объем суспензии были подобраны так, чтобы при полном оседании клеток на дне чашки образовался их монослой (Оптимально 2.5 мл суспензии с концентрацией 5.5 х 106 клеток/мл, при использовании чашек Петри диаметром 35 мм). После завершения инкубации биочипы несколько раз ополаскивали PBS для устранения не связанных с антителами клеток. Качество отмывки оценивали при помощи инвертированного микроскопа: клетки должны были отсутствовать вне пятен биочипа (областей с нанесенными антителами).
Окраска связанных клеток флуоресцентно меченными антителами. На предметное стекло параллельно друг другу наклеивали две ограничительные пластины толщиной 0.2 мм. Между ними наносили 80 мкл раствора флуоресцентно мечен-
Рис. 1. Плотность заполнения связавшимися клетками поверхности пятен биочипа с антителами анти-СП45 (а), анти-СШ6 (б) и анти-СБ8 (в). Увеличение Х37.5.
ных антител, смешанных с инактивированной нагреванием человеческой сывороткой (10% по объему). Сверху помещали биочип таким образом, чтобы его края опирались на ограничительные пластины; при этом сторона биочипа со связанными клетками была обращена вниз. Биочип мог быть дополнительно закреплен полосками скотча, наклеенными поверх него. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре биочип отделяли от предметного стекла, трижды ополаскивали PBS и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа. Каждое пятно фотографировали при обычном и ультрафиолетовом освещении с помощью цифрового фотоаппарата Kodak DC260, смонтированного на флуоресцентном микроскопе Leica Dm/RBE ("Leica", Германия).
Окраска и морфологическое исследование клеток. Препараты высушивали, фиксировали метанолом (10 мин) и окрашивали по Романовскому-Гимзе. После завершения окраски биочипы промывали водой, высушивали и наклеивали на предметные стекла. С помощью светового микр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.