БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 5, с. 731 - 741
УДК (577.112.6+577.171.6):612.112.94
ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ОКТАРФИНА, СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТУ 12-19 ß-ЭНДОРФИНА
© 2011 г. Ю.А. Ковалицкая1, Ю.Н. Некрасова1, В.Б. Садовников1, Ю.А. Золотарев2, Е.В. Наволоцкая1*
1 Филиал Учреждения РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,
142292Пущино Московской обл., просп. Науки, 6; факс: (496)733-0527, электронная почта: navolotskaya@fibkh.serpukhov.su
2 Учреждение РАН Институт молекулярной генетики, 123182 Москва, пл. Академика Курчатова, 2; факс: (495)196-0221,
электронная почта: zolya@img.ras.ru
Поступила в редакцию 24.11.10
Синтезированы пептид TPLVTLFK, аминокислотная последовательность которого соответствует фрагменту 12—19 ß-эндорфина (авторское название — октарфин), и его аналоги (LPLVTLFK, TLLVTLFK, TPLVLLFK, TPLVTLLK, TPLVTLFL). Получен меченный тритием октарфин ([3Н]октарфин, удельная активность 28 Ки/моль) и изучено его связывание с перитонеальными макрофагами мыши. Установлено, что [3Н]октарфин связывается с макрофагами с высокой аффинностью (Kd = 2,3 ± 0,2 нМ) и специфичностью. Специфическое связывание [3Н]октарфина с макрофагами ингибировали немеченые ß-эндорфин и селективный агонист неопиоидного рецептора ß-эндорфина синтетический пептид иммунорфин (SLTCLVKGFY) (K = 2,7 ± 0,2 и 2,4 ± 0,2 нМ соответственно) и не ингибировали немеченые налоксон, а-эндорфин, у-эн-дорфин и [Ме^]энкефалин (K¡ > 10 мкМ). Ингибирующая активность немеченых аналогов октарфина была более чем в 100 раз ниже, чем у немеченого октарфина. Показано, что октарфин стимулирует активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo: при концентрации 1—10 нМ он увеличивал адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов, а также их способность переваривать бактерии вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 in vitro; внутрибрюшинное введение пептида (20 мкг/животное за 7, 3 и 1 сутки до выделения клеток) приводило к возрастанию активности перитонеальных макрофагов, а также T- и В-лимфоцитов селезенки.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ß-эндорфин, налоксон, пептиды, рецепторы, иммунная система.
Известно, что р-эндорфин связывается (помимо опиоидных и 8-рецепторов [1]) с впервые описанным Хейзум с соавт. [2] неопиоид-ным (не чувствительным к опиоидному антагонисту налоксону) рецептором. В 1980 г. Джули-ард с соавт. обнаружили в составе тяжелой цепи человека кортикотропин - и р-эндорфинпо-добные последовательности [3]. Затем Хоук с соавт. синтезировали тетрадекапептид 8ЬТС1У-КОРУР8В1, соответствующий р-эндорфинподоб-ной последовательности ^О (фрагмент 364—377 Сн3-домена тяжелой цепи) и показали, что он
Принятые сокращения: Кон А — конканавалин А, ЛПС — липополисахарид, ФА — фагоцитарная активность, ЦПД — цитопатическое действие бактерий, ФЧ — фагоцитарное число.
* Адресат для корреспонденции.
конкурирует с 1251-меченным р-эндорфином за связывание с мембранами головного мозга крысы [4]. Позднее нами был синтезирован и исследован р-эндорфинподобный декапептид 8ЬТ-СЬУКОРУ (авторское название — иммунор-фин), соответствующий последовательности 364—373 тяжелой цепи ]^О(1—4) человека [5] Эксперименты показали, что меченный 1251 или тритием иммунорфин с высоким сродством и специфичностью связывается с неопиоидным рецептором р-эндорфина Т-лимфоцитов человека [6—9], перитонеальных макрофагов мыши [10, 11], синаптических мембран головного мозга крысы [12], а также клеток человеческой Т-лимфобластной линии 1игка1 [13]. Изучение биологической активности иммунорфина показало, что он увеличивает индуцированную мито-геном пролиферацию Т-лимфоцитов человека
in vitro [6—9], активирует перитонеальные макрофаги мыши in vitro и in vivo [10, 11], стимулирует рост человеческих T-лимфобластных клеточных линий Jurkat и MT-4 [13, 14], ингибиру-ет активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию глюкокортикоидов из надпочечников в кровь [15], стимулирует процессы клеточного деления ранних эмбрионов мыши и образование зрелых бластоцист in vitro [16, 17]. Исследование распределения неопиоидного рецептора р-эндорфи-на в организме крысы показало, что он имеется на клетках иммунной (макрофаги и лимфоциты), нервной (синаптические мембраны головного мозга), эндокринной (мембраны коры надпочечников) и сердечно-сосудистой (мембраны миокарда) систем [18].
Недавно нами в целях определения фрагмента p-эндорфина наименьшей длины, способного с высоким сродством связываться с не-опиоидным рецептором, была синтезирована панель фрагментов p-эндорфина и исследована способность каждого ингибировать специфическое связывание [3Н]иммунорфина с перито-неальными макрофагами мыши. В результате было установлено, что синтетический пептид TPLVTLFK, соответствующий последовательности 12—19 P-эндорфина, (авторское название — октарфин) является самым коротким фрагментом гормона, имеющим практически такое же сродство к неопиоидному рецептору, как имму-норфин и р-эндорфин [19, 20].
Цель настоящей работы — изучение влияния октарфина на активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали [Ме^]энкефалин, р-эндорфин, налоксон, тафтсин, 1,3,4,6-тетрах-лор-3а,6а-дифенилгликоурил (йодоген), среды для культивирования клеток, фетальную сыворотку теленка («Sigma», США); L-глутамин и Hepes (ICN, США); пенициллин и стрептомицин («Gibco», США); агарозу, сахарозу, БСА, ЭДТА, ЭГТА, Tris, фенилметилсульфонилфто-рид (PMSF), азид натрия (NaN3) («Serva», Германия), [метил-3Н]тимидин (удельная активность 76 Ки/ммоль), сцинтиллятор Unisolv 100 («Amersham», Англия). N-Метилпирролидон, диизопропилкарбодиимид, 1-гидроксибензот-риазол и тиоанизол были приобретены у фирмы «Мегск» (Германия). Все остальные реагенты и растворители были отечественного производства и использовались после соответствующей очистки.
Мышей линии BALB/c получали из питомника ФИБХ РАН. Иммунорфин (SLTCLVKGFY), ок-тарфин (TPLVTLFK) и его аналоги (LPLVTLFK, TLLVTLFK, TPLVLLFK, TPLVTLLK, TPLVTLFL) были синтезированы на автоматических синтезаторах, (модели 430A и C250 фирм «Applied Biosystems» и «Vega Coupler» (США) соответственно) с использованием Boc/Bzl-тактики наращивания пептидной цепи и очищены препаративной обращенно-фазовой хроматографией (хроматограф Gilson фирмы «Gilson» (Франция)) на колонке Waters SymmetryPrep C18 (19 х 300 мм) («Malva», Греция), как описано ранее [10, 21]. В качестве постоянных защитных групп были использованы 2-хлорбензилоксикарбонильная и дихлорбензильная для лизина и тирозина соответственно. По завершении сборки защищенной полипептидной цепи конечный продукт деблокировали с одновременным отщеплением его от полимера с помощью безводного фтористого водорода в присутствии скавенджеров. Синтезированные пептиды охарактеризованы данными аналитической обращено-фазовой ВЭЖХ (хроматограф Gilson, колонка XTerra RP18 («Malva»), аминокислотного анализа (гидролиз 6 М HCl, 24 ч, 110°; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus (Швеция)) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Fin-nigan, США).
[3Н]октарфин получали реакцией высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) [22]. К раствору 2,0 мг октарфина в 0,5 мл воды добавляли 50 мг окиси алюминия и упаривали на роторном испарителе. Окись алюминия с нанесенным пептидом смешивали с 10 мг катализатора (5% Rh/Al2O3). Полученную твердую смесь помещали в ампулу объемом 10 мл. Ампулу вакуумиро-вали, заполняли газообразным тритием до давления 250 мм рт. ст., нагревали до 170° и выдерживали при этой температуре в течение 20 мин. Затем ампулу охлаждали, вакуумировали, продували водородом и повторно вакуумировали. Меченый пептид экстрагировали из твердой реакционной смеси двумя порциями по 3 мл 50%-ного водного этанола, полученный раствор объединяли и упаривали. Для удаления лабильного трития процедуру повторяли дважды. Очистку [3Н]октарфина проводили методом ВЭЖХ со спектрофотометром Beckman при длинах волн 254 и 280 нм, колонкой Kromasil 4 х 150 мм (зернение 5 мкм при 20°, элюент — 0,1%-ная триф-торуксусная кислота, градиент метанола 42—70% за 20 мин, скорость потока 3 мл/мин). Включение трития в пептид рассчитывали с использованием жидкостного сцинтилляционного счета.
Реакцию связывания [3Н]октарфина с пери-тонеальными макрофагами мыши проводили в
среде 199, содержащей Hepes (25 мМ), NaN3 (20 мМ), PMSF (0,6 мг/мл), pH 7,4, в соответствии со следующей схемой: в силиконизиро-ванные пробирки вносили 100 мкл меченого пептида (1010—10-7 М, три параллельные пробы для каждой концентрации), 100 мкл среды (общее связывание) или 100 мкл 10—3 М раствора немеченого пептида в среде (неспецифическое связывание) и 800 мкл суспензии клеток (1,2 х 107 клеток в 1 мл среды). Пробирки инкубировали при 4° в течение 1 ч. По окончании инкубации для отделения связавшегося с клетками меченого пептида от несвязавшегося (свободного) реакционную смесь фильтровали через стеклово-локнистые фильтры GF/C («Whatman», Англия). Фильтры трижды промывали 5 мл ледяного физиологического раствора. Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика LS 5801 («Beckman», США). Специфическое связывание [3Н]октарфина с клетками определяли по разности между его общим и неспецифическим связыванием, а неспецифическое связывание [3Н]октарфина — в присутствии 10-4 М немеченого октарфина (1000-кратный избыток по отношению к самой большой концентрации меченого октарфина — 10-7 М). Для определения параметров специфического связывания меченого октарфина с макрофагами (равновесной константы диссоциации Kd и плотности рецепторов n — числа мест специфического связывания пептида в расчете на 1 клетку) строили графики зависимости отношения молярных концентраций связанного (B) и свободного (F) меченого октарфина от молярной концентрации связанного меченого пептида (B). Плотность рецепторов (n) определяли по формуле
n = (R,A)/N,
где R0 — молярная концентрация рецепторов, A — число Авогадро, N — количество клеток в 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.