ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 44, № 6, с. 694-700
УДК 615.324+615.37]:593.96
ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА НОВОГО НОСИТЕЛЯ АНТИГЕНОВ НА ОСНОВЕ КУКУМАРИОЗИДА А2-2 И МОНОГАЛАЛАКТОЗИЛДИАЦИЛГЛИЦЕРОЛА
© 2008 г. И. А. Ли*, А. М. Попов*, А. В. Цыбульский**, Н. М. Санина**, Э. Я. Костецкий,** О. Д. Новикова*, О. Ю. Портнягина*, А. В. Мазейка**
*Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток, 690022;
e-mail: irinali@piboc.dvo.ru **Дальневосточный государственный университет, Владивосток, 690000 Поступила в редакцию 26.07.2007 г.
Изучены морфологические и иммуноадъювантные свойства нового носителя антигенов, состоящего из комплекса тритерпенового гликозида кукумариозида А2-2 (КД) с холестерином и моногалак-тозилдиацилглицерола из Ahnfeltia tobuchiensis (МГДГАО и Ulva fenestrata (МГДШД С помощью электронной микроскопии показано образование гомогенных тубулярных структур из КД, холестерина и МГДГ в молярном соотношении 1 : 2 : 3. После иммунизации животных мономерной формой порообразующего белка из возбудителя псевдотуберкулеза, включенного в носитель, отмечали си-нергическое действие КД и МГДГ на синтез специфических антител, интерлейкина-1, у-интерферо-на и реакции гиперчувствительности по сравнению с полным адъювантом Фрейнда и иммуностимулирующими комплексами на основе сапонинов из Quillaja saponaria и яичного фосфатидилхолина. Иммуностимулирующий эффект зависит от состава полиненасыщенных жирных кислот МГДГ. Новый тубулярный адъювантный носитель антигенов на основе КД, получаемого из промыслового вида дальневосточной голотурии Cucumaria japonica, и МГДГ из морских водорослей может стать альтернативой иммуностимулирующим комплексам.
Введение субъединичных иммуногенов в составе липидных носителей рассматривается, как перспективный подход к повышению эффективности и направленного воздействия на иммунную систему современных вакцинных препаратов [1]. При этом самые значительные успехи достигнуты при получении носителей на основе некоторых растительных сапонинов, сочетающих собственную иммуностимулирующую активность со структурообразующими свойствами. В данном контексте следует отметить использование тритерпеновых гликози-дов из Quillaja saponaria Molina (Qs) в качестве основы так называемых иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ). Указанные сапонины образуют с холестерином и фосфолипидами корпускулярные структуры, которые самопроизвольно включают амфифильные субъединичные антигены патогенных бактерий, вирусов, опухолей и обладают высокой иммуноадъювантной активностью [2].
ИСКОМ существенно стимулируют пролиферацию и функциональную активность антителообра-зующих клеток, а также регуляторных хелперных T-клеток, ответственных за развитие клеточного звена иммунной системы [3]. Во многом такое действие связывают с повышением эффективности поглощения липид-сапониновых комплексов, главным образом дендритными клетками, которые активно участвуют в процессинге и представлении
антигена Т-хелперным клеткам [4]. Перспективность использования липид-сапониновых носителей обусловлена их высокой иммунологической эффективностью и возможностью включать в них любые субъединичные антигены и антигенные детерминанты [5]. Однако отсутствие стандартизации химического состава сапонинов из Qшttaja создает проблемы для использования вакцинных препаратов на основе ИСКОМ среди людей. В связи с этим особый интерес представляет поиск новых более эффективных индивидуальных сапонинов, проявляющих при совместном введении с антигеном структурообразующие и иммуноадъювантные свойства.
Уникальным источником мембраноактивных тритерпеновых гликозидов, имеющих высокое сродство к холестерину и обладающих широким спектром биологической активности, в том числе оказывающих и иммуномодулирующее действие, являются голотурии [6, 7]. Например, кукумари-озид А2-2 (КД) из кукумарии Cucumaria japonica в низких, нетоксичных для организма дозах повышает неспецифическую устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям [8], а комплекс КД с холестерином обладает высокой иммуноадъювантной активностью [9]. Указанные выше данные свидетельствуют о перспективности этого гликозида для разработки на его основе нового поколения ИСКОМ.
Важную роль в составе адъювантного носителя антигенов для их эффективного представления может играть молекулярная структура матриксного липида. При этом особое значение имеет проявление последним неламеллярных свойств, которые должны усиливать включение белкового антигена в составе носителя и увеличивать его стабильность внутри комплекса [10, 11]. Ранее нами было показано [12, 13], что неламеллярный гликолипид монога-лактозилдиацилглицерол (МГДГ) обладает структурообразующими свойствами и не изменяет морфологических характеристик классических ИСКОМ, поэтому может быть использован в качестве липид-ной структурной составляющей вместо классических фосфолипидов. Известно, что МГДГ из морских макрофитов, в отличие от фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) из яичного желтка, обычно используемых для формирования ИСКОМ, характеризуются высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) n-3 и n-6 серий [14], которые по-разному влияют на физико-химические свойства как самого полярного липида [15], так и на свойства ассоциированных с ним белков [16, 17]. Их содержание и соотношение могут оказывать существенное влияние на стимулирование иммунного ответа [12, 13]. Поэтому в качестве матриксного липида наряду с классическим яичным ФХ мы использовали МГДГ из двух морских водорослей Ahnfeltia tobuchiensis и Ulva fenestra-ta, которые существенно отличаются по составу полиненасыщенных жирных кислот [14].
Цель исследования - разработка нового перспективного адъювантного носителя антигенов на основе тритерпенового гликозида КД из голотурии Cucumaria japónica, холестерина и МГДГ из морских водорослей с оценкой его иммуностимулирующего действия в сравнении с ИСКОМ и адъювантом Фрейнда.
МЕТОДИКА
Материалы. Яичный ФХ получали в соответствии с методикой [18]. Холестерин (ХОЛ), полный адъювант Фрейнда, сапонины из Quillaja saponaria (Qs) и меченные пероксидазой антимышиные иммуноглобулины IgG ("Sigma-Aldrich Co.", США). МГДГ выделяли из морских водорослей Ulva fenes-trata и Ahnfeltia tobuchiensis по ранее описанной методике [14]. Тритерпеновый гликозид КД из дальневосточной промысловой голотурии Cucumaria japónica, полученный по методике, описанной в работе [19], любезно предоставлен В.М. Богуславским (ТИБОХ ДВО РАН).
Получение новых носителей антигенов. Липид-сапониновые комплексы получали в соответствии с ранее описанной нами методикой [12, 13] и оценивали электронно-микроскопически при увеличении Х50000. Комплексообразующие свойства КД оценивали по появлению ультрамикроскопических струк-
тур в препаратах, содержащих КД, холестерин и (или) мембранообразующие липиды в молярных соотношениях (ФХ-МГДГ) 1 : 2 : (1-5) соответственно.
В качестве антигена использовали термически обработанную гидрофобную, мономерную форму порового белка наружной мембраны возбудителя псевдотуберкулеза Yersinia pseudotuberculosis с молекулярной массой около 36 кДа, который был получен согласно ранее опубликованной методике [20].
Липид-сапониновые комплексы с включенным поровым белком получали согласно [12, 13], а именно на стадии солюбилизации липидной пленки. Для оценки связывания порина с комплексом проводили ультрацентрифугирование при 45000 g в течение 45 мин. Содержание несвязанного белка определяли в надосадочной жидкости методом Лоури. Свойства комплексов как адъювантных носителей антигенов были изучены с использованием субъединичного порового белка. При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что процесс взаимодействия порина с комплексом не изменяет его морфологическую структуру. Эффективность связывания порина достигала 95%.
Иммунологические исследования. В иммунологическом эксперименте использовали мышей линии CBA массой 18-20 г. Иммунизацию животных порином в физиологическом растворе (ФР) (контроль) и в составе комплексов (опыт) проводили двукратно с интервалом в 14 сут внутрибрюшинно (в/б) в дозе 10 мкг/мышь в объеме 0.2 мл фосфатно-солевого буфера. В качестве референтного носителя использовали полный адъювант Фрейнда, образующий масляную эмульсию с раствором антигена. В эксперименте также формировали группу интакт-ных животных (интактный контроль). Содержание поринспецифических антител определяли в сыворотке крови мышей через 28 сут твердофазным им-муноферментным методом с использованием анти-мышинных IgG, меченных пероксидазой согласно [20]. Сыворотки неиммунизированных животных служили в качестве отрицательного контроля. Концентрацию антител выражали в единицах оптической плотности при длине волны 492 нм. Для определения гиперчувствительности замедленного типа сенсибилизированным животным за 1 сут до усыпления в подушечку задней лапки вводили половинную дозу поринового антигена в объеме 0.02 мл. Местную воспалительную реакцию оценивали в день анализа путем определения веса опытной и контрольной лапок мышей.
Полученные результаты выражали в процентах от интактного контроля и представляли в виде средних арифметических 3 независимых экспериментов с учетом нормированного отклонения (доверительная вероятность 0.95). Достоверность различий выборочных средних определяли с помощью t-крите-рия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Характерной особенностью многих известных сапонинов является способность специфически связывать стерины клеточных мембран и образовывать с ними нерастворимые комплексы. Указанное свойство лежит в основе механизма мембранолити-ческого действия гликоалкалоидов, тритерпеновых и стероидных гликозидов [21, 22]. При взаимодействии морских тритерпеновых гликозидов с мембранными стеринами в результате их эквимолярно-го связывания обычно происходит образование необратимого комплекса [23].
В процессе электронно-микроскопического исследования стеринсвязывающих и комплексо-образующих свойств КД обнаружено образование стабильных липид-гликозидных комплексов, включающих морской тритерпеновый глик
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.