РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 280-287
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ИММУНОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ ОЛИГОСАХАРИДОВ ХИТОЗАНА
В СИСТЕМЕ IN VITRO
© 2009 г. А.Р. Халимов, М.М. Бикбов, И.В. Максимов*,
С.В. Си бир як
Уфимский НИИ глазных болезней АН РБ, Уфа, Россия; *Институт биохимии и генетики УНЦРАН, Уфа, Россия; "Институт иммунологии и физиологии УрОРАН, Екатеринбург, Россия
Поступила: 27.07.2009. Принята: 17.08.2009
Изучено влияние олигосахаридов хитозана со степенью деацетилирования 30 — 35% и 60 — 65% на показатели пролиферативной активности Т-лимфобластоидных клеток, функциональной активности моноцитов и митогенез лимфоцитов периферической крови.
Ключевые слова: хитозан, олигосахариды хитозана, иммунотропная активность, степень деацетилирования
**
ВВЕДЕНИЕ
Природный полисахарид хитин (полимер Ы-ацетил-Б-глюкозамина), его деацетили-рованное производное хитозан (полимер в-(1 ^ 4)-2-ацетамидо-2-дезокси-Б-глюкопира-нозы) и их олигомеры широко используются в различных сферах деятельности человека (медицине, парфюмерно-косметической промышленности, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и пр.). В настоящее время все активнее ведутся изыскания в области использования химически-модифицированного хитозана (а также его линейных и разветвленных олигомеров) в качестве систем доставки биологически активных пептидных молекул, в том числе и рекомбинантных цитокинов, плазмидной ДНК, регуляторных олигодез-оксинуклеотидов и интерферирующей РНК [1 — 5]. Физико-химические свойства хитоза-на позволяют создавать биодеградируемые наночастицы, которые способны транспортировать макромолекулы через слизистые оболочки, препятствовать их разрушению, обеспечивать пролонгированное высвобождение
Адрес: 450077, г. Уфа, ул. Пушкина, д. 90, ГУ «Уфимский НИИ глазных болезней» АН РБ. E-mail: azrakhal@yandex.ru
и прицельную доставку в клетки — мишени [1, 6].
В последние годы резко возрос интерес к иммунотропным свойствам этой группы природных полисахаридов, как в рамках характеристики биологической активности транспортных систем, так и в плане создания новых иммуномодуляторов. Хитин и хитозан традиционно рассматривались, в основном, с позиций иммуноадъювантного действия. В то же время, направленность и характер собственного иммунотропного эффекта этой группы полисахаридов неоднозначны. Так, экспериментально показано, что энтеральное введение микрочастиц хитина индуцирует продукцию IL-12, TNFa и IFNy, способствует развитию Th1-зависимого ответа [7]. Напротив, хитозан (85% деацетилирования, мм ~80 kD) индуцирует экспрессию в слизистой кишечника mRNA IL-4, IL-10, TGFp, способствует формированию толерогенных дендритных клеток и развитию Th2/Th3 ответа [8]. Способность к индукции толерогенных дендритных клеток, неспособных активировать Т-лимфоциты, показана для хитозана и в системе in vitro [9]. Отмечается также, что хито-зан непосредственно воздействует на функциональную активность лимфоцитов, в системе in vitro в присутствии полисахарида наблюдается гиперэкспрессия гликопротеина CD69
на B-лимфоцитах, CD4+ и CD8+ на Т-клет-ках, но пролиферативная активность не изменяется [10]. Известно, что биологическая активность хитополисахаридов в значительной мере определяется молекулярной массой и степенью деацетилирования [11]. В контексте иммунотропных (иимуноадъювантных) свойств подавляющее большинство исследований посвящено относительно высокомолекулярным хитополисахаридам. В настоящей работе в системе in vitro проведена оценка им-мунотропной активности низкомолекулярных (5—10 kD) хитоолигосахаридов, имеющих различную степень деацетилирования молекулы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Хитоолигосахариды (ХОС) были получены из предварительно очищенного хитина панцирей дальневосточных крабов (ЗАО «Биопрогресс») по методу, предложенному [12]. Кратко: первоначально проводили гидролиз хитина 65% серной кислотой, затем осуществляли удаление из сернокислого гидролизата хитина сульфат ионов, щелочную нейтрализацию и многократную отмывку ацетоном и 96% этанолом. Полученные олигосахариды хитозана имели молекулярную массу 5—10 kD (гель-фильтрация на $ерпайех G-15, $ерпайех G-25, Acrylex P-10), степень деацетилирования, в зависимости от длительности гидролиза, — 30 — 35% (X0C30) или 60-65% (XOC65). Степень ацетилирования олигомеров определялась путем ионометрического титрования. При проведении экспериментов ХОС растворяли 0,15M фосфатно-буферным солевым раствором (pH 7,2-7,4) и вносили в культуру в диапазоне концентраций от 0,01 мкг/мл до 10 мкг/мл.
Мононуклеары периферической крови условно-здоровых доноров добровольцев выделяли из венозной крови (антикоагулянт 5% ЭДТА-К3, Sigma) стандартным методом градиентного центрифугирования (Histopague 1,077, Sigma). После двукратного отмывания средой RPMI-1640 (Sigma), клетки ресуспендировали в обогащенной глутамином среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma), и 50 мкг/мл гентамицина сульфата (Sigma) (полная среда культивирования). Клетки культивировали в течении 72-х часов в лунках 96-луночных планшет (Costar) (2 х 105 клеток) (37 °С, в атмосфере, 5% CO2). Стимуляцию митогенеза осуществляли 10 мкг/мл PHA-P (Difco).
Т-лимфобластоидные клетки линии Jurkat были получены из банка опухолевых клеток
НИИ цитологии РАМН (г. Санкт-Петербург). Пассирование опухолевых клеток осуществляли в полной среде культивирования, использованы клетки в логарифмической фазе роста. В процессе экспериментов осуществляли пересев клеток в лунки 96-луночных планшет для культивирования (2 х 105 клеток/лунку).
Пролиферативную активность лимфоцитов определяли с помощью колориметрического Alamar blue теста [13], используя коммерческий раствор Alamar blue™ (Biosource), результаты оценивали путем дифференциальной спектрометрии (Д570нм-600нм) (спектрофотометр SmartSpectTMPlus, BioRad). Оценку апоптоза и структуры клеточного цикла осуществляли стандартным методом окрашивания йодидом пропидия в присутствии РНКа-зы-A (Sigma) [14].
Моноциты выделяли путем 3-часовой адгезии в лунках 48-луночных планшет для культивирования (Costar). После адгезии не прилипшие клетки смывали, сформированный монослой промывали теплой средой, затем добавляли свежую среду культивирования. Далее клетки инкубировали 24 часа без ХОС (контрольные культуры) или в присутствии ХОС (опытные культуры) и по окончанию инкубации оценивали внутриклеточную генерацию активных форм кислорода (АФК) и фагоцитарную активность клеток. Генерацию АФК оценивали цитофлуорометрически в тесте с 2'2,7'-дихлорфлуоресцеин диацетатом (DCF-DA, Sigma) (37 °C, 5% CO2, 30 мин, конечная концентрация DCF-DA в среде 10 цМ) [15]. Фагоцитарную активность определяли по интенсивности поглощения карбокси-модифи-цированных флуоресцентных частиц латекса диаметром 1,5 [im (Sigma) по методу [16]. После инкубации клеток с частицами латекса (37 °C, 5% CO2, 30 мин, соотношение латекс:клетка ~ 10:1), монослои промывали, клетки лизиро-вали (0,1% Triton X100 на PBS) и оценивали интенсивность флуоресценции лизатов (возб. 488 нм, эмис. 530 нм) на флуориметре VersaFluor (BioRad). Результат выражали в относительных единицах флуоресценции (RFU).
Проточную цитофлуорометрию осуществляли на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter). Анализ протоколов проточной цитофлуорометрии осуществляли в рамках программного обеспечения FCS Express V3 Research Edition (Denovo-Software).
Статистическая обработка результатов произведена в рамках программного обеспечения Statistica для Windows (версия 6.0).
Таблица 1. Влияние олигосахаридов хитозана (ХОС) (MM 5 — 10 kDa) на митогенный ответ лимфоцитов периферической крови здоровых доноров (Alamar blue Assay). ХОС вносили в культуру одновременно с митогеном. Инкубация 72 часа.
Условия культивирования ХОС30(п - 8) ХОС65 (п - 8)
PHA-P ХОС, мкг/мл
0,01 0,1 1,0 10,0 ДОП570-600 нм ДОП570-600 нм
64,0± 35,8 76,1 ± 44,3
+ 66,0± 32,9 77,0± 42,8
+ 73,6 ± 29,4 79,1 ± 36,9
+ 82,0 ± 40,0 83,9 ± 47,8
+ 90,4 ± 48,8 86,3 ± 60,5
+ 557,9 ± 247,9 608,7 ± 184,5
+ + 560,9 ± 244,8 612,9 ± 257,9
+ + 518,1 ± 273,9 494,8 ± 289,6
PSt - 0,05
+ + 406,7 ± 187,6 503,3 ± 306,3
PSt - 0,03 PSt - 0,03
+ + 444,3 ± 210,4 553,7 ± 332,7
PSt - 0,056
Использован критерий Стьюдента для сопряженных признаков на гистограммах данные представлены, как средние значения ± доверительный интервал при в = 0,95.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние хитоолигосахаридов (ХОС) на мито-генез лимфоцитов периферической крови
Результаты оценки влияния ХОС на проли-феративную активность Т-лимфоцитов пери-
ферической крови иллюстрирует таблица 1. Как ХОСЗО, так и, в меньшей степени, ХОС65 вызывали увеличение спонтанной (не стимулированной митогеном) пролифе-ративной активности лимфоцитов, однако, вследствие высокой вариабельности результатов, статистически значимой стимуляции не было. ХОСЗО статистически значимо не изменял интенсивности митогенеза лимфоцитов в диапазоне концентраций от
Таблица 2. Влияние олигосахаридов хитозана (ХОС) на интенсивность апоптоза и структуру клеточного цикла в 72-часовых культурах РНА-стимулированных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров
Условия культивирования Относительное содержание клеток, % (M ± SD)
PHA-P Концентрация ХОС в среде Апоптоз (гиподип-лоидный пик) G0 + G1 пик S+ G2 + M пик
0,1 1 10
ХОС30 (п - 6) + + + + + + + 6,1 ± 2,6 6,8 ± 2,3 7,4 ± 2,8 PSt - 0,012 7,0 ± 2,8 66.7 ± 9,9 69.8 ± 9,5 71,7 ± 4,0 70,0 ± 4,9 15,8 ± 6,6 13,3 ± 5,8 9,9 ± 2,5 Pst - 0,036 122,8 ± 3,5
ХОС65 (п - 6) + + + + + + + 5,7 ± 1,7 7,3 ± 0,7 Pst - 0,04 6,1 ± 1,6 Pst - 0,016 5,7 ± 1,7 68,4 ± 12,2 77,2 ± 9,8 71,8 ± 9,9 71,2 ± 13,1 16,0 ± 6,4 11.3 ± 5,5 Pst - 0,005 14.4 ± 5,6 Pst - 0,016 15,4 ± 5,4
0,01 мкг/мл до 0,1 мкг/мл, но при возрастании концентрации хитоолигосахарида в среде до 1 мкг/мл наблюдалось статистически значимое угнетение митогенеза, а дальнейшее возрастание концентрации приводило к снижению эффекта. ХОС65 также подавлял митогенный ответ лимфоцитов, но эффективные концентрации сост
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.