МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 491-497
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.024
ИМПОРТИН-ßl ИГРАЕТ КЛЮЧЕВУЮ РОЛЬ В ПРОЦЕССЕ ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ТРАНСПОРТА MARVELD1#
© 2015 г. Z. Y. Wang, M. Shi, Y. Li*
School of Life Science and Technology, Harbin Institute of Technology, Harbin, 150001 China
Поступила в редакцию 20.08.2014 г.
Принята к печати 03.10.2014 г.
Белок 1 с MARVEL-доменом (MARVELD1) синтезируется в нормальных тканях, но его уровень снижен в опухолях. MARVELD1 связывается с импортином-ßl — одним из белков, вовлеченных в процесс ядер-но-цитоплазматического транспорта. Биологическое значение связывания MARVELD1 с импортином-в1 изучали методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, с помощью которой анализировали распределение MARVLED1 в клетках после нокдауна гена импортина-ßl. Показали, что в ядре концентрация MARVLED1 снижается, а в цитоплазме повышается. Методом GST-pull down и вестерн-бло-тинга определили сродство нормального импортина-ßl к нескольким укороченным вариантам MARVELD1 и сродство нормального MARVELD1 к укороченным вариантам импортина-ßl. Выявили несколько участков связывания MARVELD1 с импортином-ßl. Эти результаты позволяют сделать вывод, что импортин-ßl служит посредником в неклассическом пути ядерно-цитоплазматического транспорта MARVELD1. Обнаружено также, что нокдаун импортина-ßl повышает содержание MARVELD1 в клетке. Принимая во внимание аномальное снижение экспрессии MARVELD1 в тканях опухолей, можно предполагать, что результаты представленной работы помогут лучше понять роль MARVELD1 в системе сигнальных путей в ходе канцерогенеза.
Ключевые слова: белок—белковые взаимодействия, ядерно-цитоплазматический транспорт, MARVELD1, импортин-ßl.
IMPORTIN-pi PLAYS A KEY ROLE IN THE NULCEOCYTOPLASMIC TRANSPORTATION PROCESS OF MARVELD1, by Z. Y. Wang, M. Shi, Y. Li* (School of Life Science and Technology, Harbin Institute of Technology, Harbin, 150001 China; *e-mail: lilugene@hit.edu.cn). While MARVEL domain-containing protein 1 (MARVELD1) is widely expressed in normal tissue, its expression is decreased in tumor tissue. Importin-pi is a kind of nucleocytoplasmic transport protein, which participates in protein transportation between the nucleus and cytoplasm. It has been known that MARVELD1 binds importin-p1. To define the biological functions of the binding between MARVELD1 and importin-p, 1confocal laser scanning microscopy was applied to confirm the distribution of MARVLED1 in the cells when importin-p1 is knocked down, and the results show that MARVLED1's concentration is decreased in the nucleus and elevated in the cytoplasm. GST-pull down and western blot were applied to test the binding affinity between the normal importin-p 1and several truncations of MARVELD1and the binding affinity between the normal MARVELD1 and several truncations of importin-p1. These results show that there exist several binding points between MARVELD1 and importin-p1. Basing on these results one can come to a conclusion that importin-p1 mediates the non-classical nucleocytoplasmic transportation of MARVELD1. It was also found that knockdown of importin- p 1leads to an increase in the total density of MARVELD1. Considering the abnormally reduced expression of MARVELD1 in tumor tissue, the results of this study will help gaining a better understanding of the roles of MARVELD1 in the signal network systems during tumorigenesis in cancer cells.
Keywords: protein—protein interaction, nucleocytoplasmic transportation, MARVELD1, importin-ß1. DOI: 10.7868/S0026898415030192
Белок 1 с доменом MARVEL (MARVELD1), состоящим из 173 аминокислотных остатков, принадлежит к семейству белков, все члены кото-
#Текст представлен авторами на английском языке.
* Эл. почта: lilugene@hit.edu.cn
рого содержат структурный мотив, названный MARVEL. Домен MARVEL имеет М-подобную топологию, построенную из четырех трансмем-
бранных спиралей с направленными в цитоплазму N- и C-концами [1]. Домен MARVEL обычно встречается в трансмембранных или связанных с мембраной белках, таких как синаптофизин [2], окклюдин [3] и CKLF-подобный член семейства белков с MARVEL-доменом (CMTM) [4]. Показано, что функции большинства MARVEL-бел-ков связаны с апоптозом [5], клатрин-опосредо-ванным эндоцитозом [6], хемотактической активностью [7], слиянием миобластов [8] и плотными контактами [9]. Однако в отличие от других белков с MARVEL-доменом, функции которых связаны с трансмембранными или мембранными структурами, MARVELD1 вовлечен в канцерогенез [10]. По данным анализа на микроматрицах, ген MARVELD1 гиперметилирован при раке легкого [11], чувствителен к микрогравитации [12] и сверхэкспрессируется при раке толстой кишки [13].
Ранее было показано, что белок MARVLED1 находится преимущественно в ядре и имеет сродство к белку, связанному с транспортом в нуклео-плазму, импортину-ß! [14]. Эти данные указывают на возможное участие импортина-ß! в транспорте MARVELD1 в ядро. Необходимо точно определить сайт(ы) связывания, чтобы понять, связано ли взаимодействие между MARVELD1 и импортином-ß! с транспортом MARVELD1 из цитоплазмы в ядро и/или другими биологическими функциями.
Мы сконструировали несколько укороченных форм импортина-ß 1 и MARVELD, чтобы определить сайты связывания импортина-ß! и MARVELD. Обнаружение связи между импор-тином-ß! и MARVELD1 позволит получить информацию о функциях MARVELD1 и о биологической значимости аффинного взаимодействия между MARVLED1 и импортином-ß 1, а также о характере ядерно-цитоплазматического транспорта MARVELD1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Нокдаун импортина-р1 in vitro. Для выяснения роли импортина-ß 1 в процессе транслокации MARVELD1 в ядро необходимо изучить распределение MARVELD 1 в клетках с нормальным и сниженным уровнем импортина-ß 1. С целью нокдауна гена импортина-ß! были сконструированы две миРНК с нуклеотидной последовательностью 5'-ACC TGC CCA CTT TCC TTG TG-3' и 5'-CTC TGC TGA TAT TGT GCC TTG A-3', и отрицательный контроль 5-CTC ACG ACT ATC CTA TCC GTG A-3. Клетки HeLa и A549-P18 растили в 12-луночных планшетах до плотности 40%. миРНК инкубировали с Lipofectamine 2000 в среде OptiProSFM в течение 15 мин и добавляли к клеткам. После инкубации в течение 48 ч клетки лизировали в буфере RIPA, содержащем 1 мM лейпептина, 1 мM пепстатина A и 1 мM PMSF
(фенилметансульфонилфторид). Лизаты анализировали методом вестерн-блотинга. Импортин-ß1 выявляли антителами sc-1919 к кариоферину-ß1 (N-19) и конъюгатом пероксидазы хрена со вторыми антителами — аффинно очищенными IgG кролика против иммуноглобулинов козы — с окрашиванием с системе имиджинга двухцветной инфракрасной флуоресценции Odyssey ("LI-COR").
Распределение MARVELD 1 при подавлении экспрессии импортина-р1. Мы подтверждали эффективность миРНК, а затем с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) выявляли MARVELD1 в линиях клеток HeLa и A549-P18, способных стабильно экспрессировать MARVELD1. Трансфекцию клеток проводили как описано ранее. После отмывки однократным фосфатно-солевым буфером (PBS) клетки фиксировали 4%-ным параформальдеги-дом в 1х PBS в течение 15 мин. Параформальдегид отмывали PBS, клетки перфорировали 0.5%-ным Тритоном X-100 в течение 5 мин. Образцы пропитывали 3%-ным BSA в 1х PBST и смачивали раствором поликлональных первичных антител кролика к MARVELD1(ab91640) в 3%-ном BSA в разведении 1 : 150 в течение 32 ч при 4. В качестве вторых антител использовали TRITC-конъюги-рованные аффинно очищенные антикроличьи IgG козы, растворенные в 1х PBST, в соотношении 1 : 100. Клеточные ядра окрашивали раствором DAPI (1 : 1000) в 1х PBS.
Конструирование рекомбинантных плазмид, несущих кДНК MARVELD1 и его укороченных вариантов. Для получения MARVELD1 и его укороченных вариантов (аминокислотные остатки 1— 35, 1—60, 1—93, 36—173), связанных с покрытыми GST (глутатион^-трансфераза) шариками, сконструировали рекомбинантную плазмиду pGEX-6P-1-MARVELD1. Учитывая высокое содержание GC в кДНК MARVELD1, сконструировали праймеры, специфичные к MARVELD1 (табл. 1). Для расщепления полноразмерной и укороченных кДНК, а также плазмиды использовали ре-стрикционные экзонуклеазы BamHI и XhoI (37°C, 30 мин). Для встраивания вариантов кДНК в плазмиду использовали инкубацию с T4-ДНК-лигазой в течение 12 ч при 16°C. Рекомбинантны-ми плазмидами трансформировали компетентные клетки Top10, проводили скрининг на устойчивость к ампициллину (Amp) и секвенирование ДНК.
Конструирование рекомбинантных плазмид для экспрессии импортина-р1 и его укороченных вариантов. Антитела sc-1919 к кариоферину ß1 (N-19) могут узнавать N-концевую область импортина-ß 1. Для определения специфических участков импор-тина-ß!, необходимых для связывания с MARVELD1, создали серию делеционных мутантов импортина-ß, содержащих His-тэг. Праймеры для получения укороченных вариантов (1—321,
1—485, 318—876) и полного белка приведены в табл. 2. Делеционные варианты кДНК получили с помощью ПЦР и представленных в табл. 2 прай-меров. В качестве вектора использовали плазмиду pET 28a, а в продукты ПЦР ввели сайты рестрикции XhoI и BamHI. После отбора клонов по устойчивости к канамицину (Kana) и подтверждения структуры с помощью секвенирования ДНК рекомбинантные плазмиды вводили в клетки BL21.
Анализ аффинного связывания укороченных вариантов MARVELD1 и интактного импортина-ßl.
Клетки BL21, содержащие рекомбинантные плазмиды, культивировали при 37°C до достижения оптической плотности 0.6 при 600 нм и добавляли 1 М раствор IPTG до конечной концентрации 0.8 мМ. После выращивания при 28°C с перемешиванием со скоростью 200 об./мин в течение 12 ч клетки BL21 промывали холодным 1х PBS, а затем осаждали центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин при 4°C. Осадок клеток суспендировали в лизирующем буфере, содержащем 1 мМ PMSF, 1 мМ лейпептин и 1 мМ пепстатин A. Клетки разрушали ультразвуком в Ranson Sonifier на льду (4 раза по 20 с при мощности импульса 250 w), охлаждали в течение 30 с на льду. Лизаты осветляли центрифугированием при 12000 об./мин в течение 5 мин дл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.