МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 2, с. 322-332
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ^^^^^^^^
АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.152.351
In silico СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДОКИНГ
ПЕРВОЙ ГЛЮКУРОНОКСИЛАН-КСИЛАНГИДРОЛАЗЫ (Xyn30A) СЕМЕЙСТВА 30 ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ (GH30) ИЗ Clostridium thermocellum#
© 2014 г. Anil Kumar Verma, Arun Goyal*
Department of Biotechnology, Indian Institute of Technology Guwahati, Guwahati, 781039, Assam, India
Поступила в редакцию 13.06.2013 г.
Принята к печати 22.08.2013 г.
CtXynGH30 — модульный фермент, который расщепляет углеводы и входит в состав целлюлосомы Clostridium thermocellum. CtXynGH30 содержит N-концевой каталитический модуль, названный Xyn30A, и С-концевой углевод-связывающий модуль (СВМ), принадлежащий к семейству 6. Для создания молекулярной модели проведено моделирование Xyn30A c помощью компьютерной программы Modeller9v8 и кристаллической структуры XynC из Bacillus subtilis в качестве шаблона. Уточнение модели проведено с использованием минимизации энергии по алгоритму градиентного спуска c силовым полем GROMOS96 43a1. Оценка качества модели с помощью карты Рамачандрана показала, что 91% аминокислотных остатков расположен в наиболее благоприятной области и 9% — в дополнительной допустимой области. По данным структурного анализа Xyn30A относится к структурам с укладкой бочонок (ß/a)8 и содержит также обогащенную ß-тяжами структуру, названную "боковой ß-структурой", присоединенную к основному каталитическому ядру. Результаты наложения структур показывают, что Glu136 действует как каталитическая кислота/основание, а Glu225 — как каталитический нуклеофил. Множественное выравнивание последовательностей указывает на то, что эти каталитические остатки консервативны в пределах семейства. Согласно результатам докинга они обеспечивают полярное взаимодействие с линейными и замещенными ксилоолигосахаридами. Анализ взаимодействия с лигандом установил, что ароматические аминокислотные остатки ТГр81, Tyr139, ТГр143, Phe172, His198, Tyr200, Tyr227, ТГр264 и Tyr265 образуют карман сайта связывания вокруг активного сайта. В представленной работе описаны общие особенности структуры, консервативные остатки активного центра и докинг фермент-лиганд первой глюкуроноксилан-ксилангидролазы (Xyn30A) семейства 30 гликозилгидролаз (GH30) из C. thermocellum.
Ключевые слова: гликозилгидролазы, семейство 30, Clostridium thermocellum, Xyn30A, гомологичное моделирование, гетероксиланы, связывание лигандов.
In silico STRUCTURAL CHARACTERIZATION AND MOLECULAR DOCKING STUDIES OF FIRST GLUCURONOXYLAN-XYLANOHYDROLASE (Xyn30A) FROM FAMILY 30 GLYCOSYL HYDROLASE (GH30) FROM Clostridium thermocellum, by Anil Kumar Verma, Arun Goyal* (Department of Biotechnology, Indian Institute of Technology Guwahati, Guwahati, 781039, Assam, India; *e-mail: arungoyl@iitg.ernet.in). CtXynGH30 is a carbohydrate active modular enzyme and component of cellulosome of Clostridium thermocellum. The full length CtXynGH30 contains an N-terminal catalytic module named as Xyn30A and a family 6 carbohydrate binding module (CBM6) at C-terminus. Xyn30A was modeled by computer program Modeller9v8 taking crystal structure of XynC from B. subtilis as a template to generate the molecular model. Model refinement was done using energy minimization by implementing steepest descent algorithm with GROMOS96 43a1 force field. Quality assessment by Ramachandran plot showed that 91% amino acids lie in most favourable region and 9% in additional allowed region. Structural analysis depicted that Xyn30A has a (P/a)8 barrel fold. Additionally, it had a p-strand rich structure called 'side p-structure' attached with main catalytic core. Structural superimposition reflected that Glu136 act as a catalytic acid/base while Glu225 act as a catalytic nucleo-phile. Multiple sequence alignment showed that these catalytic residues are conserved within the family. The docking results showed that these residues display polar interaction with linear and substituted xylo-oligosac-charides. The binding interaction of ligands depicted that aromatic amino acids Trp81, Tyr139, Trp143, Phe172, His198, Tyr200, Tyr227, Trp264 and Tyr265 create binding site pocket around the active site. We re-
# &атья представлена на английском языке.
* Эл. почта: arungoyl@iitg.ernet.in
port overall structural feature, conserved active site residues and enzyme-ligand docking of first glucuronoxy-lan-xylanohydrolase (Xyn30A) of family 30 glycosyl hydrolase (GH30) from Clostridium thermocellum.
Keywords: glycoside hydrolase family 30, Clostridium thermocellum, Xyn30A, homology modeling, heteroxy-lans, ligand binding.
DOI: 10.7868/S0026898414020025
ВВЕДЕНИЕ
Полисахариды растений — химически сложные структуры, главные компоненты которых целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин [1]. Гемицеллюлоза — гетерополисахарид, который состоит в основном из ксилана, второго по представленности полимера, наряду с глюканами, маннанами и арабинанами. Из-за гетерогенности и сложности структуры кси-лана для его полной деградации до простых сахаров необходимы различные ферменты [2, 3], поэтому у некоторых анаэробных микроорганизмов и грибов возникли системы мультиферментных комплексов, называемых целлюлосомами. Грамположительная термофильная анаэробная бактерия Clostridium thermocellum характеризуется самой высокой скоростью утилизации целлюлозы [4, 5]. В постоянно обновляемой базе данных CAZy, содержащей действующие на углеводы ферменты, систематизированные по сходству аминокислотных последовательностей и результатам анализа гидрофобных кластеров [6], белок CtXylGH30, входящий в состав целлюлосомы C. thermocellum, сначала отнесли к семейству 5 гликозилгидролаз (GH). Однако после выравнивания аминокислотных последовательностей и филогенетического анализа этот белок переклассифицировали и отнесли к подсемейству Н семейства 30 GH глюкуроноксилан-ксилангид-ролаз (подсемейство 8 в базе данных CAZy) [7]. К настоящему времени охарактеризована структура только двух белков этого подсемейства — XynC из грамположительной бактерии Bacillus subtilis (PDB id: 3GTN) и XynA (PDB id: 1NOF) из грам-отрицательной фитопатогенной бактерии Erwinia chrysanthemi. Изучена кристаллическая структура обоих белков — как нативных, так и их комплексов с лигандами [8, 9]. Еще четыре белка семейства GH30 охарактеризованы биохимически: Xyn5B из Bacillussp. штамм BP, активная в отношении нейтральных незамещенных ксилоолигоса-харидов [10], и Xyn30D из Paenibacillus barcinonensis, которая эффективно гидролизует глюкуроноксила-ны и разветвленные ксилоолигосахариды, содержащие метилглюкуроновую кислоту [11]. Xyn30A из B. licheniformis SVD1 охарактеризована как глюку-роноарабиноксилан-эндо-1,4-Р-ксиланаза [12], а XynD — как ксиланазаAeromonascaviae ME-1 [13].
Глюкуроноксилан состоит из линейного остова, образованного соединенными Р-(1-4)-связя-ми .D-ксилопиранозными единицами и содержа-
щего в качестве заместителей остатки а^-глюку-роновой кислоты ^1сА) или 4-О-метил а-D-глюкуроновой кислоты (MeG1cA) в положении 02, присоединенные через а(1-2)-гликозидную связь. Глюкуроноксилан — главный компонент вторичной клеточной стенки лиственных растений и растительных остатков, составляющих значительную часть растительной биомассы [14]. Кси-ланазы GH30 подсемейства Н специфически гид-ролизуют ксиланы определенного типа, такие как глюкуроноксиланы, т.е. они отличаются от других ксиланаз, принадлежащих к семействам GH5, GH10 и GH11, члены которых расщепляют внутренние ксилозидные связи в основном в линейных ксилоолигосахаридах, проявляя эндо-1,4-Р-ксиланазную активность [15]. Глюкуроноксилан-ксиланогидролаза отличается от ксиланаз семейств GH39 и GH43, которые обладают Р-ксило-зидазной активностью, образуя, следовательно, в качестве главного продукта ксилозу [16, 17]. Глю-куроноксилан-ксиланогидролаза также отличается от а-глюкуронидаз семейства GH 67, которые расщепляют а(1-2)-гликозидные связи остатков G1cA илиг MeG1cA, заместителей основной цепи ксилана [18]. Ксиланазы семейства GH30 нуждаются в ксиланах, декорированных остатками G1cA или MeG1cA. Они расщепляют Р-1,4-ксилозидные связи вблизи положений а(1-2)-замещающих остатков G1cA или MeG1cA [19]. Для полной деградации глюкуроноксиланов необходимо кумулятивное действие эндо-1,4-Р-ксиланазы, Р-ксила-назы и а-глюкуронидазы. Микробные ксиланазы применяются в производстве бумаги и пульпы, биоконверсии растительных полисахаридов в продукции биоэтанола, улучшении качества кормов для животноводства, в хлебопекарной и пивоваренной промышленности [20—23].
Представленная работа посвящена изучению особенностей структуры, консервативных каталитических аминокислотных остатков и возможного механизма катализа первой глюкуронокси-лан-ксиланогидролазы (Xyn30A) из C. Легшосе1-Шш. Нами также проанализирован полученный с помощью докинга комплекс фермент-лиганд. Получена ценная информация об остатках ароматических аминокислот, расположенных в каталитическом ядре и об их возможной роли в связывании субстрата.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аминокислотная последовательность и определение границ модулей в CfXynGH30. Последовательность (acc. ABN54208 и ID A3DJS9) получена из базы данных CAZy (http://www.cazy.org/). Границы доменов модулей CtXynGH30 определили путем анализа результатов, полученных при помощи программ PSI-Blast [24] и InterProScan [25]. N-концевой сигнальный пептид выявляли с использованием программы signalP [26]. Окончательную подгонку границ доменов осуществили путем выравнивания последовательностей с использованием программы Clustal X [27].
Моделирование по гомологии. Модель каталитического модуля Xyn30A построена с применением компьютерной программы Modeller9v8 [28]. Эта программа использует информацию, полученную путем сравнительного моделирования структуры белка, первая стадия которого — выравнивание изучаемой последовательности с наиболее сходным шаблоном белка с известной структурой. XynC семейства GH30 из B. subtilis 168 (PDB id: 3GTN) выбран в качестве основы для моделирования стр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.