МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 885-892
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.152.313
ИНАКТИВАЦИЯ ГЕИА pgsA ВЛИЯЕТ НА БИОСИНТЕЗ И СЕКРЕЦИЮ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ Escherichia coli
© 2003 г. В. В. Головастое1, Е. В. Анисимова2, М. А. Несмеянова1*
1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 2Пущинский государственный университет, Пущино, Московская обл., 142290 Поступила в редакцию 21. 02.2003 г.
Показано, что инактивация гена pgsA, ответственного за синтез анионного фосфолипида - фосфа-тидилглицерина, влияет на биосинтез и секрецию щелочной фосфатазы Escherichia coli. Снижение содержания фосфатидилглицерина, а не анионных фосфолипидов в целом, коррелирует с подавлением секреции щелочной фосфатазы, что подтверждает участие этого фосфолипида в секреторном процессе. В условиях значительного снижения содержания фосфатидилглицерина (с 18 до 3%, но не до 8% от общих фосфолипидов) подавляется не только секреция щелочной фосфатазы, но и ее синтез. При инактивации гена pgsA ускоряется также репрессия синтеза белка экзогенным ортофосфатом.
Ключевые слова: щелочная фосфатаза, биосинтез, репрессия, секреция, фосфатидилглицерин, Es-cherichia coli.
Фосфолипиды - важнейшие компоненты клеточных мембран, и у E. coli представлены цвитте-рионным фосфатидилэтаноламином (ФЭА) - 70%, анионными фосфолипидами (АФЛ): кардиолипи-ном (КЛ) и фосфатидилглицерином (ФГ) - 1-5% и 20% соответственно, а также фосфатидной кислотой (ФК) - 0.1% [1]. Они участвуют в структурной организации мембран, определяя их избирательную проницаемость, являются матриксом для мембранных белков и ферментов, а также их эффекторами и кофакторами [2]. Фосфолипиды участвуют также в биогенезе компонентов клеточной оболочки: липополисахарида [3], липо-протеина [4], периплазматических олигосахари-дов [5] как их метаболические предшественники. К настоящему времени накоплено много экспериментальных данных, свидетельствующих об участии как анионных [6-11], так и цвиттерион-ного [12-14] фосфолипидов в транслокации белков через цитоплазматическую мембрану, которые подтверждают гипотезу об этом участии, впервые высказанную в нашей лаборатории [15]. Показано, что АФЛ требуются для функционирования белковых компонентов секреторного аппарата [16, 17]. Они также взаимодействуют с положительно заряженным N-концевым участком сигнального пептида предшественников белков
Принятые сокращения: PhoA и преРИоА - щелочная фосфатаза и ее предшественник соответственно, ФЭА - фос-фатидилэтаноламин, КЛ - кардиолипин, ФГ - фосфатидилглицерин, ФК - фосфатидная кислота, АФЛ - анионные фосфолипиды; ТХУ - трихлоруксусная кислота.
* Эл. почта: aniram@ibpm.serpukhov.su
при инициации секреции [7, 18]. Такое взаимодействие, как следует из результатов стереохимичес-кого анализа, стабилизирует комплекс "сигнальный пептид-анионные фосфолипиды", улучшая тем самым кинетические параметры инициации секреции [7, 19]. Цвиттерионные фосфолипиды могут участвовать в секреторном процессе путем формирования небислойной структуры мембран, которая способствует транслокации белка через мембрану [13, 14, 20]. Недавно показано [21], что эти фосфолипиды взаимодействуют с N-конце-вой областью зрелой полипептидной цепи, помогая, как предполагается, ее входу в "транслокон". Кроме того, с помощью мутантного штамма E. coli AD93, не способного синтезировать ФЭА, установлено, что дисбаланс фосфолипидов, вызванный отсутствием ФЭА, влияет не только на секрецию щелочной фосфатазы (PhoA), но и на экспрессию ее гена phoA, контролируемого собственным промотором PPHO [14]. Однако вклад индивидуальных фосфолипидов в секрецию и биосинтез белка и молекулярный механизм их вовлечения в эти процессы остаются мало изученными.
В наших ранних работах получены первые косвенные доказательства участия ФГ в секреции PhoA E. coli [22-24]. Его содержание и обмен увеличивались в процессе секреции белка [24], и именно он был обнаружен в участке мембран, через который транслоцируется белок [25]. Позднее участие ФГ в секреции было подтверждено в опытах с инвертированными мембранными везикулами, обедненными АФЛ [26, 27]. Транслока-
ция npePhoE через мембраны этих везикул снижалась, однако она восстанавливалась при введении в них ФГ с помощью липид-переносящего белка [27]. Тем не менее прямые доказательства участия этого фосфолипида в секреции белка in vivo отсутствуют. Остается неясным - вносит ли именно ФГ вклад в секрецию или он может быть заменен другим анионным фосфолипидом. Неизвестно также, влияют ли изменения в содержании анионного ФГ на процесс биосинтеза белка.
Цель настоящей работы - выявить влияние анионного фосфолипида фосфатидилглицерина на биосинтез и секрецию щелочной фосфатазы E. coli. Для этого анализировали биосинтез и секрецию PhoA в мутантных штаммах E. coli HD30/pHD102 и HL30/pHD102, в которых синтез ФГ контролируется температурочувствительной плазмидой pHDl02 с клонированным геном pgsA, ответственным за синтез этого фосфолипида.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали изогенные штаммы E. coli HD30 (pgsA30::kan) и HL30 (pgsA30::kan lpp-2) [28], которые лишены ответственного за синтез ФГ гена pgsA и содержат плазмиду pHD102 с этим геном, репликация которой чувствительна к температуре. В отсутствие этой плазмиды штаммы нежизнеспособны. Для повышенного синтеза PhoA указанные штаммы трансформировали плазмидами pHI-1 или pHI-7 с геном phoA под контролем собственного промотора PPHO, которые сконструированы на основе одного и того же вектора pBR322 и несут фрагменты PstI (6.3 т.п.н.) и HpaI-XhoI (2.8 т.п.н.) [29].
Условия выращивания. Клетки E. coli выращивали на минеральной среде [30] до середины логарифмической фазы при 30° и 42°С при интенсивной аэрации, используя механическую качалку. Для поддержания плазмиды pHI-1 использовали тетрациклин (12.5 мкг/мл), плазмиды pHI-7 - ампициллин (100 мкг/мл), а плазмиды pHD102 - хлорам-феникол (25 мкг/мл). Для индукции синтеза PhoA клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, промывали 0.14 М NaCI, переносили на среду, не содержавшую ортофос-фат, и инкубировали при 30° и 42°С. Для репрессии синтеза PhoA через 30 мин после начала индукции к клеткам добавляли 1 мМ ортофосфат и продолжали инкубацию в течение 20 мин. Через определенные интервалы времени отбирали пробы культуры для последующих анализов и добавляли мертиолят в конечной концентрации 0.005% для остановки биосинтетических процессов.
Секреция щелочной фосфатазы. Секрецию PhoA оценивали двумя методами. Первый метод заключался в анализе фосфатазной активности
клеточной культуры, т.к. PhoA становится функционально активной только после транслокации белка через цитоплазматическую мембрану в периплазму [31], второй - в анализе динамики превращения импульсно меченого предшественника щелочной фосфатазы (преР^А) в зрелую форму (созревание щелочной фосфатазы) за счет отщепления сигнального пептида после транслокации белка [32].
Созревание щелочной фосфатазы. Клетки E. coli, собранные в середине логарифмической фазы роста, инкубировали в течение 10 мин на среде, не содержавшей ортофосфат, для индукции синтеза PhoA, импульсно метили [358]-метиони-ном (50 мкКи/мл) в течение 60 с и останавливали включение метки добавлением немеченой аминокислоты. В определенные промежутки времени отбирали пробы культуры, белки осаждали 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ), преР^А и PhoA иммунопреципитировали с помощью антител против денатурированной PhoA и анализировали электрофорезом с последующей радиоавтографией и денситометрией.
Биосинтез щелочной фосфатазы оценивали по иммуноблотингу PhoA с использованием кроличьих антител против денатурированной PhoA и конъюгата белка А с пероксидазой хрена ("BioRad", США) [33].
Синтез тотальной РНК оценивали по включению ее меченого предшественника, [14С]-ураци-ла, во фракцию, нерастворимую в ТХУ. Меченый урацил добавляли в культуру клеток в момент индукции синтеза PhoA в количестве 0.05 мкКи/мл. Через определенные промежутки времени отбирали пробы, обрабатывали их равным объемом холодной 20%-ной ТХУ и фильтровали через фильтры Microfibre GF/F ("Whatman", Англия). Радиоактивность измеряли с помощью сцинтилляци-онного счетчика SL-30 ("Intertechnique", Франция).
Фосфолипидный состав. Липиды экстрагировали по методу Эймса [34]. Тонкослойную хроматографию фосфолипидов проводили на пластинах с силикагелем Kieselgel-60 ("Merck", Германия), предварительно обработанных 50%-ным этанолом, содержащим 1.2%-ную борную кислоту, в системе хлороформ : метанол : вода : гидроокись аммония (60 : 37.5 : 3 : 1 (v/v)) [35]. Пятна индивидуальных фосфолипидов проявляли в парах йода, вырезали, экстрагировали из силикагеля смесью хлороформ : метанол : вода (5 : 5 : 1 (v/v)) и содержание фосфора в липидах определяли, как описано ранее [36].
Аналитические методы. Электрофорез белков проводили в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата натрия [37]. Активность PhoA определяли по скорости гидролиза ий^а-нитрофенилфосфата [30], принимая за единицу ферментативной активности (Е) количе-
Влияние температуры культивирования на фосфолипидный состав клеток E. coli
Штамм E. coli Температура Содержание фосфолипидов, мол. %
КЛ ФГ ФЭА ФК АФЛ
HD30/pHD102/pHI-1 30°С 4.3 ± 0.9 17.5 ± 2.2 76.6 ± 1.5 1.6 ± 0.8 23.4
42°С 3.6 ± 1.3 3.4 ± 1.0 88.5 ± 2.3 4.5 ± 1.0 11.5
HL30/pHD102/pHI-7 30°С 5.6 ± 0.9 17.9 ± 3.2 74.5 ± 2.9 2.0 ± 1.0 25.5
42°С 4.0 ± 1.8 8.0 ± 2.4 84.5 ± 3.6 3.5 ± 0.7 15.5
Примечание. КЛ - кардиолипин; ФГ - фосфатидилглицерин; ФЭА - фосфатидилэтаноламин; ФК - фосфатидная кислота; АФЛ - анионные фосфолипиды (ФГ + КЛ + ФК). Представлены средние значения данных десяти независимых опытов.
ство мкмолей субстрата, гидролизуемого ферментом в течение 1 мин при 37°С. Активность PhoA определяли в культуре клеток (клетки + + культуральная среда), т.к. щелочная фосфата-за, кодируемая геном в составе плазмиды, частично секретируется в среду [38]. Бело
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.