РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 567-574
ОБЩАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК [57+61]::539.1.04:612.017:614.87
ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ, РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И ОКСИДАТИВНОГО
СТАТУСА У ЖИТЕЛЕЙ МОСКВЫ
© 2013 г. И. И. Пелевина1*, А. В. Алещенко2, М. М. Антощина3, О. В. Кудряшова1, М. Ф. Никонова4, Н. И. Рябченко3, А. М. Серебряный2, А. А. Ярилин!4
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва 2Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 3Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации, Обнинск
4Институт иммунологии ФМБА России, Москва
На стимулированных ФГА лимфоцитах периферической крови жителей Москвы изучали экспрессию маркеров активации (СБ69) и пролиферации (К167) Т-лимфоцитов человека, связи содержания этих показателей между собой, с оксидативным статусом (содержанием активных форм кислорода — АФК) и радиочувствительностью, измеренной по числу клеток с микроядрами (МЯ). Было показано, что содержание Т-лимфоцитов с маркерами СБ69 и К167 коррелирует между собой (г = 0.571; р = 0.0004), т.е. для продвижения клеток по циклу необходима экспрессия маркера СБ69 (через 24 ч после стимуляции), но она недостаточна для проявления высокой экспрессии маркера К167 через 48 ч после стимуляции (в фазе синтеза ДНК). Было обнаружено, что содержание Т-лимфоцитов с маркером СБ69 и Т-лимфоцитов с маркером К167 связаны отрицательной корреляцией с частотой облученных клеток с МЯ (облучение в дозе 1 Гр через 48 ч после стимуляции) — г = —0.487, р = 0.010; г = —0.440, р = 0.008 соответственно. Т.е. можно полагать, что радиочувствительность лимфоцитов уменьшается по мере возрастания экспрессии маркеров активации и пролиферации. Показано также, что радиочувствительность лимфоцитов не связана с оксидативным статусом, определяемым по содержанию АФК, в том числе супероксидного анион радикала. Возможно, это объясняется тем, что концентрацию АФК определяли в нестимулированных лимфоцитах, в то время как частоту клеток с МЯ в стимулированных. При отдельном анализе индивидуальных различий по изученным показателям, измеренным у одних и тех же людей, оказалось, что в ряде случаев индивидуальные различия достаточно велики для радиочувствительности при облучении клеток через 48 ч после стимуляции, концентрации АФК, содержания клеток с маркерами активации и пролиферации. Таким образом, поиски коррелятивных связей не обнаружили важные и интересные зависимости. Важным выводом представляется наличие значительных индивидуальных различий в экспрессии маркеров активации и пролиферации, в числе клеток с МЯ, в оксидативном статусе у обычных жителей Москвы.
Лимфоциты периферической крови, маркер активации СБ69, маркер пролиферации Ш67, активные формы кислорода, радиочувствительность, коррелятивные связи.
БО1: 10.7868/80869803113060118
Среди разных клеток крови зрелые Т-лимфо-циты отвечают за реакции клеточного иммунитета и осуществляют иммунологический надзор за антигенным гомеостазом организма. Образуясь в костном мозге, они далее дифференцируются в тимусе, приобретая клеточные рецепторы (TCR) и поверхностные маркеры. Имеющиеся на поверхности и в ядре маркеры могут свидетельствовать об участии лимфоцитов крови в определенных реакциях клеток, организма, развитие которых у каждого индивидуума зависит от
* Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ул. Косыгина, 4, ИХФ РАН; тел.: (495) 939-74-47; e-mail: pele@chph.ras.ru.
содержания конкретных маркеров и количества клеток с ними. В данной работе изучали содержание Т-лимфоцитов с маркером СЭ69 и с маркером К167 у жителей Москвы. Эти маркеры были выбраны потому, что они играют важную роль в иммунных и многих других клеточных реакциях.
СЭ69 — интегральный мембранный белок, его экспрессия, как правило, наблюдается при воздействии разных стимулов; его баланс и регуляция экспрессии, связанные с внеклеточными сигналами, важны в координации регуляции иммунной реакции [1]. Маркер СЭ69 является гли-копротеином с лектиновой цепью С-типа, его экспрессия индуцируется на клетках гемопоэти-
ческих тканей, Т- и В-лимфоцитах, NK-клетках, макрофагах [2]. Широкое распространение в клетках, индукция других внутриклеточных сигналов говорят о его многофункциональности; имеются данные о его роли в патогенезе таких заболеваний, как ревматоидный артрит, хронические воспалительные процессы, астма, синдром иммунодефицита; предполагается, что он может служить мишенью для терапии этих заболеваний [3] и активации иммунитета при операциях на сердце и приживлении трансплантата [4]. По последним данным, высокая экспрессия СЭ69 связана с сердечной фибрилляцией и играет прогностическую роль [5].
СЭ69 служит маркером ранней активации и далее действует как стимулирующая молекула для активации и пролиферации Т-лимфоцитов, являясь плейотропным иммунным регулятором, потенциально важным для активации и дифференциации NK и других гемопоэтических клеток [6-7].
Еще один маркер клеточного иммунитета — Ю67. Экспрессия этого белка отражает определенное физиологическое состояние клетки, связанное с пролиферацией. Во время интерфазы антиген находится среди нуклеоплазмы, а в митозе перемещается на поверхность хромосом [8]. Ю67 обнаруживается в клетках, находящихся в любой стадии клеточного цикла: С1, 62 и митозе, кроме фазы С0, что делает его хорошим маркером для определения фракции роста (т.е. всех способных к делению клеток), его экспрессия необходима для прогрессии клеток по циклу [8]. Уровень экспрессии Ю67 и число Т-лимфоцитов, включивших бромдезоксиуридин, строго коррелируют, что говорит о том, что белок Ю67 является общим количественным маркером пролиферации [9].
Динамика появления Ю67 после стимуляции клеток следующая: отсутствие в интактных лимфоцитах (менее 1% клеток), через 24 ч после стимуляции — 5% лимфоцитов, через 48 ч — 45%, через 72 ч — 74% [10]. После деления у клеток в С1-фазе наблюдается уменьшение экспрессии Ю67, в ¿-фазе — снова возрастание [11].
Следует отметить, что Ю67 во многих случаях служит прогностическим биомаркером для выявления некоторых опухолей, в частности, это касается рака предстательной железы [12—13]. При этом содержание маркера К167 является основанием для принятия решения о наличии опухоли и проведении лечения при низких значениях про-стат-специфического антигена (ПСА). Показано, что при значениях ПСА, обычно не являющихся признаком необходимости вмешательства, высокие значения Ю67 подтверждали наличие опухоли [14]. Маркер К167 считается важным прогно-
стическим фактором и в случае рака молочной железы, часто наряду с другими показателями [15—16].
Обнаружено, что облучение лимфоцитов крови увеличивает экспрессию маркера СЭ69, но ин-гибирует включение бромдезоксиуридина в клетки, по которому можно судить о пролиферации [17]. В литературе также имеется много данных о связи радиочувствительности и пролифератив-ной активности, начиная с работы Бергонье и Трибандо [18].
Как известно, активные формы кислорода (АФК) принимают участие в поддержании внутриклеточного гомеостаза, в регуляции ряда биологических процессов, в процессах старения, воспаления, синтеза белков, в реакции клеток на внешние воздействия, в передаче сигналов, в патогенезе и развитии ряда заболеваний [19]. Ранее нами было показано, что у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС через много лет после облучения содержание АФК отличается от их содержания у необлученных индивидуумов, что говорит о возможной роли оксидативного статуса в формировании нестабильности генома [20].
Целью настоящей работы было исследование экспрессии биомаркера ранней активации лимфоцитов СЭ69 и маркера пролиферативной активности Ю67, концентрации активных форм кислорода; возможной связи этих показателей между собой и с радиочувствительностью лимфоцитов здоровых людей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Периферическую кровь от условно-здоровых людей, проживающих в Москве, забирали в ваку-тейнеры с гепарином (20 ед./мл). Всего был обследован 41 человек. На одних и тех же образцах крови параллельно определяли содержание иммунологических маркеров, оксидативный статус и радиочувствительность.
Выделение лимфоцитов крови
Разделение клеточных элементов крови проводили путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-верографи-на (плотность 1.077 г/мл, "ПанЭко") по методу Воуит А. После центрифугирования при 400 % в течение 30 мин при 20°С отбирали интерфазное кольцо мононуклеаров и дважды отмывали средой Игла ("ПанЭко"). Количество выделенных лимфоцитов подсчитывали в камере Горяева и доводили до нужной концентрации. Жизнеспособность выделенных клеток, определяемая с помощью 0.1%-ного трипанового синего, была выше 95%.
Определение содержания Т-лимфоцитов с маркерами CD69/Ki67
Работу проводили на Т-лимфоцитах периферической крови, содержащих в мембранном комплексе CD3, связанный с клеточным рецептором TCR, и обеспечивающий передачу сигнала о его взаимодействии с антигеном. Выделенные лимфоциты ресуспендировали в полной культураль-ной среде RPMI-1640 с 25 ммоль/л HEPES ("Sigma"), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma") и 2 ммоль/л L-глутамина, и культивировали в присутствии ФГА-П ("Sigma") в концентрации 10 мкг/мл в течение 24 или 48 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО2.
Для определения поверхностного маркера CD69 использовали меченные фикоэритрином (PE) моноклональные антитела к CD69 ("Dako"), меченные флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) антитела к CD3 "Сорбент" и меченные PerCP антитела к CD3 ("Becton Dickinson"). Клетки отмывали в среде Игла, содержащей 0.1% азида натрия ("Sigma"), инкубировали с антителами в течение 30 мин при 4°С, дважды отмывали центрифугированием от не связавшихся антител и фиксировали 1%-ным параформальдегидом ("Sigma").
Для определения экспрессии внутриклеточного маркера пролиферации Ki67 использовали моноклональные антитела, меченные FITC ("eBio-science") и специальный набор фиксирующих и пермеабилизирующих реактивов для выявления внутриклеточных молекул ("eBioscience"). После окрашивания клеток поверх
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.