ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 1, с. 42-49
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ (РЕГЕНЕРАЦИЯ)
УДК 616.089.843:611.81
ИНДУКТИВНАЯ РОЛЬ МШИСТЫХ ВОЛОКОН ГИППОКАМПА В РАЗВИТИИ ДЕНДРИТНЫХ ШИПИКОВ ПРИ АБЕРРАНТНОМ СИНАПТОГЕНЕЗЕ В УСЛОВИЯХ НЕЙРОТРАНСПЛАНТАЦИИ © 2014 г. З. Н. Журавлева, Г. И. Журавлев*, С. С. Хуцян*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН *Институт биофизики клетки РАН 142290 Пущино, Московская область, ул. Институтская, д. 3 E-mail: zhuravleva@iteb.ru Поступила в редакцию 05.07.13 г.
Окончательный вариант получен 19.08.13 г.
Зубчатую фасцию гиппокамповой формации, выделенную из 20-дневных плодов крыс Вистар, ге-теротопически трансплантировали в соматосенсорную область неокортекса взрослых крыс той же породы. Через 5 месяцев после операции нейротрансплантаты с соседней областью неокортекса были исследованы с помощью световой и электронной микроскопии. Было проведено детальное изучение ультраструктуры эктопических синаптических окончаний, образованных аксонами гранулярных нейронов зубчатой фасции (мшистыми волокнами) с несвойственными им в норме нейронами неокортекса. Ультраструктурный анализ показал, что большинство эктопических синапти-ческих окончаний воспроизводит свои детерминантные морфологические характеристики: гигантские размеры пресинаптических бутонов, активные зоны с разветвленными дендритными шипиками и адгезионные соединения с поверхностью дендритов. Данные указывают на то, что прорастающие из нейротрансплантатов мшистые волокна индуцируют структурно-химическую реорганизацию дендритов неокортекса, используя трансмембранные адгезивные соединения типа punc-ta adherentia. Это приводит к дифференцировке активных зон и развитию типичных для гигантских синаптических окончаний дендритных шипиков, инвагинированных в пресинаптические термина-ли. Таким образом, способность нейронов зубчатой фасции к формированию аберрантных синап-тических связей в условиях трансплантации обусловлена индуктивными синаптогенными свойствами мшистых волокон.
Ключевые слова: гетеротопические нейротрансплантаты, зубчатая фасция, ультраструктура, мшистые волокна, аберрантные гигантские синапсы, разветвленные дендритные шипики, адгезионные контакты.
DOI: 10.7868/S0475145014010078
ВВЕДЕНИЕ
При развитии мозга в норме специфичность формирования аксональных синаптических связей управляется пространственно-временными факторами и комплексом химических сигналов. Мшистые волокна гиппокамповой формации (аксоны гранулярных нейронов зубчатой фасции) заканчиваются в строго ограниченной области — на проксимальных отделах апикальных дендритов пирамидных нейронов поля СА3. Гигантские терминали мшистых волокон (до 5—6 мкм в диаметре) формируют интратерминальные активные зоны с разветвленными дендритными шипиками (thorny excrescences) и дополнительно прикрепляются к поверхности дендритов с помощью не-синаптических адгезивных соединений типа puncta adherentia. В условиях трансплантации эм-
бриональной нервной ткани в зрелый мозг специфичность нервных связей нарушается, в результате чего предшественники нервных клеток контактируют не только с типичными, но и с атипичными нейрональными мишенями в мозге реципиента (Magavi, Lois, 2008). После гетеротопи-ческой трансплантации зубчатой фасции в не-окортекс крыс мы наблюдали образование эктопических синаптических контактов на денд-ритах неокортикальных нейронов (Журавлева, 2002; Журавлева и др., 2011). При этом синапти-ческие окончания мшистых волокон, несмотря на несвойственные им постсинаптические ней-рональные мишени, воспроизводили свои детер-минантные структурные характеристики, что позволяло их идентифицировать среди других типов синапсов. В настоящей работе была поставле-
на задача изучить ультраструктурные особенности формирования химерных гигантских синап-тических окончаний, пресинаптическими компонентами которых являются аксоны трансплантированных гранулярных нейронов, а пост-синаптическими мишенями — нейроны сомато-сенсорной области неокортекса. Детальный анализ позволяет сделать предположение о субклеточных механизмах, обеспечивающих взаимную адаптацию трансплантированных нейронов и нейронов мозга реципиента при установлении аберрантных синаптических связей, а также оценить роль пресинаптических терминалей мшистых волокон в структурно-химической реорганизации постсинаптических дендритов неокортекса.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа была выполнена на крысах породы Ви-стар с соблюдением правил работы с животными, изложенными в Директивах Европейского Сообщества и одобренными Комиссией по биоэтике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Все процедуры с животными проводили под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно) и местной анестезией (2.0%-ный новокаин, подкожно). В качестве донорского материала использовали закладку гиппокамповой формации, выделенную под стереомикроскопом из 20-дневных плодов крыс. Реципиентами служили 9 половозрелых крыс-самцов той же породы. Над соматосенсорной областью неокортекса производили трепанацию черепа и отсасывали небольшой объем ткани мозга, куда помещали кусочек донорского материала, и закрывали пористой кровоостанавливающей губкой. Через 5 месяцев после трансплантации мозг животных фиксировали, используя метод интракардиаль-ной перфузии сначала физиологическим раствором, а затем 2.5%-ным раствором глутарового альдегида. Далее мозг выделяли, разрезали на тонкие пластины, из них вырезали трансплантат с прилежащей к нему областью неокортекса и до-фиксировали 1.0%-ным раствором осмиевой кислоты. Обработку материала для электронной микроскопии и заливку в эпон 812 производили по стандартной методике. Выбор участков для ультраструктурного исследования (трансплантат, неокортекс реципиента или интерфазу между ними) производили с помощью светооптического микроскопа на полутонких срезах, окрашенных смесью метиленовой сини и буры. Кроме того, для сравнения морфологических характеристик эктопических гигантских синапсов зубчатой фасции с таковыми в норме была проанализирована зона окончаний этих синапсов (stratum lucidum) в гиппокампе in situ из противоположного полушария. Ультратонкие срезы контрастировали ура-
нилацетатом и цитратом свинца и исследовали в электронном микроскопе JEM-100B (Япония). Синаптические окончания аксонов гранулярных нейронов зубчатой фасции идентифицировали благодаря большим размерам терминали (до 4— 6 мкм) и другим структурным признакам, известным из литературы и собственных наблюдений (Amaral, Dent, 1981; Журавлева 2002; Rollenhagen et al., 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При предварительном визуальном анализе трансплантаты были обнаружены у всех экспериментальных животных. Гистологическое изучение срезов показало хорошо васкуляризованную трансплантированную ткань, в которой присутствовали дифференцированные нервные и гли-альные клетки, четко различались фрагменты слоя гранулярных нейронов (рис. 1). Электронно-микроскопическое исследование показало, что ультраструктура гранулярных нейронов соответствует их фенотипическим характеристикам. Нейропильные зоны трансплантатов имели нормальное для мозговой ткани соотношение нервных и глиальных элементов и представляли собой плотное переплетение дендритов, аксонов, отростков астроцитов и синаптических окончаний, среди которых выделялись крупные пресинапти-ческие бутоны, принадлежащие аксонам гранулярных нейронов зубчатой фасции. В интерфазе между трансплантатами и мозгом реципиента прослеживались пучки аксонов и дендритов, которые всегда сопровождались отростками астро-цитов. Среди них идентифицировались плотно сгруппированные тонкие (0.08—0.1 мкм в диаметре) немиелинизированные аксоны гранулярных нейронов, проецирующиеся из трансплантатов в соседний неокортекс (рис. 2).
Соседний с нейротрансплантатом мозг реципиента был исследован на расстоянии до 500 мкм от интерфазы. Врастающие в мозг из трансплантатов мшистые волокна, как правило, рассеивались в неокортексе поодиночке и достоверно определялись только в случаях, если в план среза попадали их гигантские бутоны. По плотности распределения везикул пресинаптические бутоны эктопических синапсов несколько уступали гигантским синапсам гиппокампа in situ. В то же время по везикулярному составу они не различались: основу составляли малые светлые везикулы (30—40 нм) с примесью больших пузырьков (80— 120 нм) с прозрачным или электронно-плотным центром (рис. 3). Однако ранее в таких же синапсах мшистых волокон с атипичными нейрональ-ными партнерами, мы обнаружили увеличение числа больших пептид-содержащих везикул и их перераспределение из экстрасинаптических мест к активным зонам, что предполагает участие ней-
Рис. 1. Гистологический срез (окраска по Нисслю) через трансплантат зубчатой фасции (Т) и прилежащий неокортекс (Н) крысы. Стрелка — слой гранулярных нейронов в трансплантате. Масштаб: 1.0 мм.
Рис. 2. Поперечно срезанный пучок аксонов в интерфазе между нейротрансплантатом и мозгом реципиента. Я — Ядро аст-роцита; О — отростки астроцитов, сопровождающие аксоны, проникающие из трансплантата в соседний неокортекс реципиента. М — Миелинизированный аксон. Стрелка указывает на пучок тонких немиелинизированных аксонов гранулярных нейронов (мшистые волокна). Масштаб: 0.5 мкм.
ропептидных механизмов в адаптации пре- и постсинаптических партнеров друг к другу (Журавлева и др., 2007).
Окончания врастающих из трансплантатов аксонов гранулярных нейронов зубчатой фасции отличались от синаптических окончаний неокор-текса не только гигантскими размерами термина-ли, но и специфическим способом организации
функциональных взаимодействий. Как и в норме, они формировали два типа контактов: асимметричные активные зоны с дендритными шипи-ками и симметричные адгезионные соединения с поверхностью дендритов. Примечательно, что многие шипики, формирующие активные зоны с терминалями мшистых волокон, имели разветвленные головки, хотя такая форма шипиков не
Рис. 3. Гигантская терминаль (ГТ) мшистого волокна, формирующая множественные синаптические контакты (стрелки) с разветвленными головками дендритных шипиков (ДШ) в неокортексе мозга реципие
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.