БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 120-128
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.3'32/. '36:616-006:547.56
ИНДУКТОР ЭКСП P ЕССИИ ARE-P ЕГУЛИ P УЕМЫХ ГЕНОВ ФЕНОЛЬНЫЙ АНТИОКСИДАНТ ТС-13 ВЫЗЫВАЕТ ГИБЕЛЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕР ЕЗ МИТОХОНДРИАЛЬНО-ОПОСРЕДОВАННЫЙ ПУТЬ
© 2015 г. Г.Г. Мартинович, И.В. Мартинович, Н.К. Зенков*, Е.Б. Меньщикова*,
Н.В. Кандалинцева**, С.Н. Черенкевич
Белорусский государственный университет, 220030, Минск, пр. Независимости, 4, Республика Беларусь;
E-mail: тагипоу[сН%£@Ыи.Ъу *Научный центр клинической и экспериментальной медицины CО РАМН, 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2;
E-mail: 1етеп@сеШегсет.ги
**Новосибирский государственный педагогический университет, 630126, Новосибирск, ул. Вилюйская, 28
E-mail: ациарквпо1@тай.ги Поступила в p едакцию
И сследовано влияние водорастворимых фенольных антиоксидантов 3-(3'-трет-бутил-4' -гидро-ксифенил)-пропилтиосульфоната натрия (Т C-13), 3,5-диметил-4-гидроксибензилтиоэтаноата калия (БЭК-11-К) и 3-(3',5'-ди-трет-бутил-4'-гидроксифенил)-пропионата калия (фенозан-калий) на пролиферативную активность опухолевых клеток и р оль р едокс-зависимых и кальций-зависимых сигнальных механизмов в реализации отклика опухолевых клеток на действие антиоксидантов. Обнаружено, что фенозан-калий и БЭК-11-К стимулировали пролиферацию, а индуктор сигнальной системы Кеар1/]^^2/АИЕ фенольный антиоксидант ТС-13 ингибировал рост опухолевых клеток в культуре. Скорость роста опухолевых клеток зависела от скорости внутриклеточной продукции активных форм кислорода и снижалась при действии ингибитора НАДФН-оксидазы апоцинина и ингибитора убихинол-цитохром с оксидоредуктазы антими-цина А. Действие ТС-13 на опухолевые клетки сопровождалось кратковременным повышением внутриклеточной продукции активных форм кислорода и ростом внутриклеточной концентрации ионов Са2+, тогда как инкубация клеток с фенозан-калием и БЭК-11-К не приводила к повышению уровня активных форм кислорода и внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Циклоспорин А блокировал ингибирующий эффект ТС-13. Это позволило предположить, что при действии фенольного антиоксиданта ТС-13 в опухолевых клетках через открытие пор высокой проводимости запускается митохондриально-опосредованный апоптоз.
Ключевые слова: рост опухолевых клеток, митохондриально-опосредованый апоптоз, водорастворимые фенольные антиоксиданты, активные формы кислорода.
Поиск и установление новых механизмов регуляции функциональной активности клеток - необходимый этап развития современных биомедицинских технологий. Широко используемыми регулято рами функционирования клеток в нормальных и стрессовых условиях являются пр ир одные и синтетические фенольные
Сокращения: Nrf2 - КБ-Е2-связанный фактор 2, Keapl -Kelch-подобный ECH-ассоциированный белок 1, ARE -антиоксидант-респонсивный элемент, ТС-13 - 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)-пропилтиосульфонат натрия, АФК - активные формы кислорода, БЭК-11-К - 3,5-ди-метил-4-гидроксибензилтиоэтаноат калия, H2DCF - 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин, DCF - 2',7'-дихлорофлуорес-цеин, ANT - адениннуклеотидный транспортер, Klf9 -Кгирре1-подобный фактор 9.
антиоксиданты. Несмотр я на то, что структурные особенности фенолов, определяющие их антиоксидантные свойства в модельных системах, достаточно хорошо исследованы, взаимосвязь между биологическим действием фенольных препар атов и их антиоксидантными свойствами зачастую не выявляется. И сследования структурно взаимосвязанного ряда бифункциональных фенольных антиоксидантов, содержащих разное количество орто-трет-бутильных заместителей, а также сульфонатные и тиосуль-фонатные группы в пара-алкильных заместителях, позволили выявить соединения с выраженными противовоспалительными свойствами in vivo [1]. Противовоспалительный эффект серо -содержащих фенольных антиоксидантов в ор-
ганизме может определяться их действием на р едок с-зависимые факто р ы тр анскр ипции, включая КЕ-Е2-связанный фактор 2 (Nrf2), тр анскрипционная активность котор ого р егу-лируется специфическим ингибитором Кеар1 (Ке1сп-подобный ECH-а ссоциир ованный белок 1). Фактор Nrf2 регулирует экспр ессию более 500 генов, главным обр азом антиоксидант-ных фер ментов и фер ментов детоксикации ксенобиотиков, в пр омотор ных областях котор ы х содержится регуляторная последовательность антиоксидант-р еспонсивного элемента (ARE) [2,3]. Показано, что одним из активных синтетических индукто р ов сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE является фенольный антиок-сидант 3-(3'-mpem-бутил-4'-гидроксифенил)-пр о -пилтиосульфонат натрия (ТС-13), содержащий тиосульфонатную гр уппу с лабильной S-S-свя-зью [1]. Обнаружено защитное действие ТС-13 пр и о стр ом [4] и хр оническом во спалении in vivo [5]. Показано также, что ТС-13 увеличивает выживаемо сть разных линий Drosophila melano-gaster в условиях окислительного стресса, ин-дуцир ованного H2O2 и пар акватом [6]. Пр и этом в нормальных условиях введение в диету фенольного антиоксиданта ТС-13 повышает продолжительность жизни у самцов и самок долгоживущей линии D. melanogaster Canton S, но снижает среднюю продолжительность жизни самцов D. melanogaster линии lgl558OR/Cy, со -держащей в гетер озиготном со стоянии р ецес-сивную летальную мутацию опухолевого су-прессора [6]. Неоднозначность действия антиоксиданта в различных экспер иментальных условиях может быть опоср едована о собенностя-ми клеточного редокс-гомеостаза, котор ый оп-р еделяет пр отекание ряда метаболических и регулятор ных процессов [7] и может влиять на биологическое действие р едокс-активных соединений. Так, напр имер, эпигаллокатехин-3-гал-лат в высоких концентрациях индуцирует генерацию активных форм кислорода (АФК) в опухолевых клетках, но ингибирует образование АФК в нормальных эпителиальных клетках [8].
В настоящее время ведутся интенсивные исследования, напр авленные на поиск и р азр а -ботку новых технологий пр отивоопухолевой терапии, задачей которых является регуляция окислительно-восстановительных процессов в клетках [9,10]. Поскольку в качестве ключевых характеристик трансформированных тканей выделяют нарушения клеточного и тканевого ре-докс-гомеостаза, в таких технологиях предла-гается использовать различные редокс-актив-ные соединения, включая фенолы [9,11]. Биологическая активность фенольного антиокси-
P ис. 1. С труктур ные фор мулы фенольных антиок-сидантов.
данта ТC-13 в условиях измененного pедокс-гомеостаза опухолевых клеток может также существенно модифицир оваться. В данной работе нами изучены влияние Т C-13 на пр олифер атив-ную активность опухолевых клеток и роль ре-докс-зависимых и кальций-зависимых сигнальных механизмов в р еализации отклика опухо -левых клеток на действие Т C-13. П р оведен анализ действия ТС-13 в опухолевых клетках в сравнении с другими водорастворимыми фе-нольными антиоксидантами, такими как сер о -содержащий 3,5-диметил-4-гидроксибензилтио-этаноат калия (БЭК-11-К ) и не содер жащий серы 3-(3',5'-ди-тpem-бутил-4'-гидроксифенил)-пр опионат калия (фенозан-калий).
МЕТОДЫ И ССЛЕДОВАНИЯ
Водоpастворимые фенольные антиоксидан-ты Т С-13, БЭК-11-К и фенозан-калий (пр епар ат ср авнения) синтезир ованы в НИИ химии анти-оксидантов (Новосибирск, Ро ссия), как описано р анее [1] (р ис. 1). В работе использовали клетки карциномы гортани человека линии НЕр-2 и клетки аденокар циномы молочной железы линии MCF-7.
Клетки карциномы гортани человека линии НЕр-2 культивир овали в ср еде MEM («Sigma-Aldridi», США) с добавлением 8-10% эмбр ио-нальной бычьей сывор отки и гентамицина (0,08 мг/мл) пр и темпер атур е 37°С в атмосфер е 5% С О 2. Клетки аденокар циномы молочной железы линии MCF-7 культивир овали в ср еде DMEM («Sigma-Aldridi», США). Для определения влияния пр епар атов на пр олифер ативную активность опухолевых клеток исследуемое со -единение добавляли в чашки Петр и чер ез 24 ч после пер есева клеток. Подсчет клеток пр ово-дили на четвер тые сутки культивир ования. Для получения суспензии клетки снимали раствором
Рис. 2. Изменение числа клеток линий НЕр-2 (а, б) и MCF-7 (в) при культивировании с антиоксидан-тами ТС-13 (а, в) и БЭК-11-К (б, в). Здесь и на рис. 3-8: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 по сравнению с контролем.
трипсин-версен в соотношении 1:1 на шестые-седьмые сутки.
Оценку внутриклеточной продукции АФК проводили на основе анализа скорости окисления флуоресцентного зонда 2',7'-дихлорди-гидрофлуоресцеина (H2DCF) [12]. Определяли начальную скор ость окисления H2DCF (V0),
начальную скор ость окисления H2DCF после добавления антиоксиданта (V 1) и конечную скорость окисления H2DCF после добавления антиоксиданта (V2). Измерения проводили при температуре 37°C в сбалансированном буферном солевом р астворе следующего со става: NaCl - 131 мМ, KCl - 5 мМ, CaCl2 - 1,3 мМ, MgSO4 - 1,3 мМ, КН2РО4 - 0,4 мМ, HEPES -20 мМ, глюкозы - 6 мМ, рН 7,4. Cуcпензию клеток нагружали H2DCF-DA («Sigma-Aldridi», CША), инкубируя с 10 мкМ зонда в течение 45 мин при температуре 37°C в сбалансированном солевом буфере. Измерение интенсивности флуоресценции 2',7'-дихлор офлуоресцеина
(DCF), образующегося пр и окислении H2DCF, проводили при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 530 нм. Для определения внутриклеточной концентрации ионов Cа 2+ ([Cа2+]цит) клетки нагружали флуоресцентным зондом fura 2-AM («Sigma-Aldrid», CША) в течение 45 мин при температуре 37°C, затем дважды отмывали в сбалансированном солевом буфере. Для деэфиризации зонда клетки инкубировали в течение 15-30 мин пр и температуре 37°C. Флуоресцентные сигналы fura 2 регистрировали при длине волны испускания 510 нм и двух длинах волн возбуждения -340 нм и 380 нм. Расчет внутриклеточной концентрации ионов Cа2+ проводили по методу Гр инкевича [13]. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием спектрофлуор имет-ра CМ 2203 научно-производственного центра «СОЛАР» (Минск, Беларусь).
В работе использовали ингибитор НАДФН-оксидазы апоцинин (1-(4-гидрокси-3-метоксифе-нил)этанон), ингибитор убихинол-цитохром c оксидоредуктазы антимицин А, ингибитор сборки митохондриальных пор высокой про -водимости цик
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.