БИОХИМИЯ, 2007, том 72, вып. 1, с. 58 - 71
УДК 577.152.1
ИНДУКТОР ГРАНУЛОЦИТАРНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ГЕКСАПЕПТИД HLDF-6 СНИЖАЕТ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ НА КЛЕТКАХ ЛИНИИ ^-60*
© 2007 г. Н.В. Гибанова, Т.В. Ракитина, В.М. Липкин, И.А. Костанян**
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (495)336-6166, электронная почта: iakost@mail.ibch.ru
Поступила в редакцию 27.06.06 После доработки 29.08.06
Изучено влияние гексапептида НРОР-6, индуктора гранулоцитарной дифференцировки, на процессы диф-ференцировки и апоптоза, вызываемые фактором некроза опухоли (ТЫР-а), на клетках линии НЬ-60 про-миелоцитарного лейкоза человека. Установлено, что при костимуляции клеток НРОР-6 и ТЫР-а усиливается гранулоцитарная дифференцировка клеток, тогда как моноцитарная не меняется, причем снижается цитотоксическое действие этого цитокина. Отмечено, что протекторный эффект пептида не связан с изменением активации транскрипционного фактора ЫР-кВ. Поскольку пептид уменьшал число клеток, вступивших в апоптоз при действии С2-церамида, медиатора ТЫР-индуцируемого апоптоза, а также значительно снижал активирующее действие ТЫР-а на каспазу-3, выдвинута гипотеза об ингибировании пептидом НЬБР-6 передачи апоптотического сигнала на одном из этапов митохондриального пути.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: клеточная дифференцировка, апоптоз, пептид НЬБР-6, ТЫР-а, клетки линии НЬ-60, транскрипционный фактор ЫР-кВ, церамид.
Апоптоз — естественный физиологический процесс, необходимый как для развития, так и для поддержания тканевого гомеостаза, эмбриогенеза и функционирования различных дифференцированных клеток [1—3]. Восприимчивость клеток миелоидного ряда к различным цитоток-сическим агентам зависит от степени их диффе-ренцировки [4—7]. При этом до сих пор остается невыясненной точная взаимосвязь между клеточной дифференцировкой и апоптозом, из-за того что механизмы, контролирующие эти процессы, частично используют схожие метаболические пути [7]. В связи с этим выяснение меха-
низмов, регулирующих развитие апоптоза в опухолевых недифференцированных и нормальных дифференцированных клетках, — один из ключевых аспектов при лечении больных различными формами лейкоза. Известно, что в процессе клеточной дифференцировки клетки миелоид-ного ряда становятся устойчивыми к действию многих индукторов апоптоза. Так, было показано, что обработка клеток НЬ-60 промиелоци-тарного лейкоза такими известными индукторами дифференцировки, как форболовые эфиры, ретиноевая кислота, витамин Б3 или диметил-сульфоксид [8—15], приводит к развитию резис-
Принятые сокращения: HLDF (human leukemia differentiation factor) — фактор дифференцировки клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека, NBT — нитроголубой тетразолий, PE — фикоэретрин, FITC — флуоресцеинизо-тиоцианат, TNF-a — tumor necrosis factor alpha, TNF-R — tumor necrosis factor receptor, TRADD — TNF-Rl-associated death domain protein, FADD -Fas-associated death domain protein, TRAF — TNF receptor-associated factor, RIP — receptor-interacting protein, NF-kB — nuclear factor kappa B, I-kB — inhibitor of NF-kappa B, IKK — I kappa B kinases, JNK — c-Jun N-termi-nal kinase, SAPK — stress-activated protein kinases, GM-CSF — granulocyte monocyte colony-stimulating factor, G-CSF — granulocyte colony-stimulating factor, G-CSFR — granulocyte colony-stimulating factor receptor, LPS — lipopolysaccharide, SOD — superoxide dismutase, ДТТ — дитиотреитол, M-MLV (Moloney murine leukemia virus) — вирус лейкоза мышей Молони, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) — глицероальдегид-3-фосфат дегидрогеназа, PBS (phosphate buffered saline) — фосфатно-солевой буфер (pH 7,4) , dNTP — 2'-дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, BSA (bovine serum albumin) — бычий сывороточный альбумин.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-171, 26.11.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
тентности клеток к различным апоптотическим стимулам, в том числе и к цитотоксичному действию TNF-a [16].
Ранее в нашей лаборатории было показано, что гексапептид HLDF-6, фрагмент эндогенного фактора дифференцировки клеток линий HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека HLDF, полностью воспроизводит дифференцирующую активность полноразмерного фактора. Установлено, что основа механизма действия HLDF-6 на клетки HL-60, не имеющего собственного рецептора на поверхности клеток, — его способность взаимодействовать с липидным компонентом клеточных мембран и изменять текучесть последних [17]. В ходе исследований было установлено, что наряду с дифференцирующей активностью гексапептид обладает ярко выраженными протекторными свойствами. HLDF-6 предохраняет от дегенерации клетки Пуркинье червя мозжечка крыс in vivo и гранулярные нейроны мозжечка крыс in vitro при индуцируемой химической гипоксии [18]. Кроме того, гексапептид повышает устойчивость клеток HL-60 и мышиных эмбрионов к холодовому шоку и ионизирующей радиации [19]. Было также продемонстрировано нейропротекторное действие этого пептида на моделях болезни Альцгеймера in vivo и in vitro [20]. Имеются данные, подтверждающие, что многие из этих процессов дегенерации клеток потенцируются фактором некроза опухоли [21].
TNF-a — Многофункциональный цитокин, принадлежащий к семейству TNF-лигандов, — секретируется многими типами клеток. TNF-a является физиологическим индуктором таких процессов, как гибель клеток в результате апоп-тоза или некроза, клеточная дифференцировка, гемопоэз, а также участвует в регуляции и реализации иммунных и воспалительных реакций [22]. Терапевтическое применение TNF-a в качестве противоопухолевого агента осложнено его общей высокой токсичностью по отношению к нормальным клеткам организма, связанной с широким спектром биологических активностей этого цитокина. Многообразие биологических свойств TNF-a опосредовано двумя высокоаффинными рецепторами (TNF-R1 и TNF-R2), принадлежащими к большому семейству рецепторов TNF-лигандов (TNF-R) [23]. В подавляющем большинстве клеток TNF-R1 является ключевым медиатором в передаче сигналов, опосредованных TNF-a, а TNF-R2, по всей вероятности, играет важную роль в функционировании лимфоидной системы [22]. При взаимодействии TNF-a с TNF-R1 и TNF-R2 на молекулярном уровне выделяют три основных эффекта, определяющих пути реализации разно-
образных клеточных ответов: активацию транскрипционного фактора NF-kB, активацию стрессактивируемых протеинкиназ (SARK/JNK), индукцию апоптоза [22]. Инициация апоптоза TNF-a осуществляется двумя путями: прямым рецепторным и митохондриальным.
Цель данной работы — исследование влияния пептида HLDF-6 на процессы апоптоза и дифференцировки, вызываемые TNF-a на клетках линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека, что является одним из этапов изучения молекулярного механизма действия этого гексапептида.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. Были использованы: среда RPMI 1640, фетальная сыворотка теленка, NBT («Sigma», Германия), смесь случайных прайме-ров, набор для очистки ПЦР-продуктов «Wizard PCR Preps DNA Purification System», dNTP, ингибитор РНКаз RNAsin, обратная транскрипта-за M-MLV («Promega», США), ингибитор РНКаз RNAaseZAP («Invitrogen», США), набор для конкурентной ПЦР «PCR MIMICTM Construction Kit» (CLONTECH, США), набор для регистрации клеток, вступивших в апоптоз «Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit» («PharMingen», США), кумасси R-250, кумасси G-250, агароза («Bio-Rad», США), набор реактивов «ECL + Plus Detection System» («Amersham Biosciences», США), Taq-полимераза (ИБХ РАН). Реактивы, используемые для приготовления буферных растворов, имели квалификацию ос.ч. или х.ч.
Рекомбинантный человеческий TNF-a был любезно предоставлен Л.Н. Шингаровой; C2-церамид — Ю.Г. Молотковским (ИБХ РАН), клеточная линия HL-60 — Р.Г. Василовым (Институт биотехнологии, Москва).
Культивирование клеток HL-60. Его проводили в среде RPMI 1640 с 10%-ной фетальной сывороткой теленка при 37° в атмосфере 5% СО2.
Дифференцирующая активность. Ее определяли по способности клеток HL-60 восстанавливать нитроголубой тетразолий (NBT-тест) по стандартной методике [24]. Клетки HL-60 (5 • 106) инкубировали c TNF-a (1 мкг/мл), HLDF-6 (10 мкМ) либо с TNF-a (1 мкг/мл) + HLDF-6 (10 мкМ) в течение 72 ч. После инкубации к клеточному осадку добавляли раствор NBT (1 мкг/мл) и инкубировали в течение 25 мин при 37° и 15 мин при комнатной температуре. По окончании реакции клетки распределяли равномерно на стекле (мазок) и фиксировали метанолом в течение нескольких минут. Клетки, содержавшие в
цитоплазме восстановленный NBT в виде темно-синих гранул формазана, подсчитывали под микроскопом (ЛОМО, Россия). В каждом образце просчитывали не менее 300 клеток. Дифференцированными считали клетки, содержавшие не менее 10 гранул. Контролем служили клетки, инкубируемые с PBS. Было проведено не менее трех независимых экспериментов в трех повторах.
Получение кДНК из клеток. Суммарную РНК выделяли из 2 • 106 клеток после инкубации с исследуемыми индукторами в течение 1, 4, 24, 48 и 72 ч с помощью набора для выделения РНК «SV Total RNA Isolation System» («Promega», США) в соответствии с инструкцией производителя. Процедура включала в себя также обработку ДНКазой, чтобы исключить загрязнение РНК-образцов геномной ДНК.
Для обратной транскрипции брали 1 мкг РНК каждого образца. Обратную транскрипцию проводили в 10 мМ dNTP, 75 мМ KCl, 5 мМ ДТТ, 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 6 мМ MgCl2, 0,002% BSA, 100 нг случайных шестичленных праймеров, 20 ед. акт. RNAsin, 200 ед. акт. обратной транскриптазы М-М1У (все реактивы фир-
мы «Promega»), Объем реакционной смеси составлял 20 мкл, реакцию проводили при 37° в течение 1,5 ч, Фермент инактивировали прогреванием при 95° в течение 15 мин, Реакционную смесь доводили до 500 мкл стерильной водой Milli-Q. Качество выделяемой РНК и эффективность обратной транскрипции проверяли ПЦР с использованием праймеров DGAP и RGAP на кДНК GAPDH (табл. 1),
Полуколичествен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.